狗脊微波炮制過程中指標成分與粉末顏色關聯性分析

梁志毅 黃貴發 崔 婷 張 正 孫冬梅

（廣東一方制藥有限公司， 廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室， 廣東 佛山528244）

狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz（L.） J.sm.干燥根莖，主要分布于浙江、江西、福建等地［1］。狗脊炮制方法歷史悠久，始見于《雷公炮炙論》：“細剉了，酒拌蒸”，自古以來其炮制品有砂燙狗脊、蒸狗脊、酒狗脊、鹽狗脊等。2015 年版《中國藥典》 收載了狗脊及燙狗脊2個炮制品種。燙狗脊為生狗脊片經砂燙法，燙至鼓起，除去殘存絨毛，即得［2］。狗脊經砂燙后質地變得疏松，便于粉碎和煎出有效成分。狗脊具有補肝腎、強筋骨、舒經絡、除濕痛的功效，經砂燙炮制后，其補肝腎作用增強［3］。狗脊砂燙后，外觀性狀上表現為顏色明顯加深，同時原兒茶酸、5-羥甲基糠醛的含有量均有不同程度的升高，5-羥甲基糠醛有很好的抗氧化及保護心血管等作用［4］。據文獻報道，狗脊在燙制過程中發生了明顯的美拉德反應，炮制過程中γ-吡喃酮和糠醛類成分增加的同時，糖和氨基酸類成分也有明顯的變化。狗脊的炮制過程，隨著化學成分的變化，其性、味均發生了相應變化［5］。傳統對砂燙狗脊的性狀描述為“燙至表面略鼓起、棕褐色”，這存在較大的主觀性和不精確性，不利于飲片的質量控制。

隨著中藥炮制技術的發展，新的技術不斷應用于中藥炮制領域。微波的基本性質通常呈現為穿透、反射、吸收，具有能量集中、穿透力強、選擇性高、加熱效率高等特點，可對非金屬物質進行加熱、干燥、脫水、滅菌、消毒，同時具有節能、省時、方便、衛生等優點［6］。近年來微波技術在中藥炮制中的應用發展迅速，有研究者利用微波技術對雷公藤、莪術、山楂等多種中藥飲片炮制進行了研究，結果顯示微波炮制品中化學成分的種類、含有量以及性狀上的變化與傳統炒制品接近［7-10］，且大大縮短了炮制時間，符合現代中藥加工節能高效的要求。

本研究以色度值L，a，b 量化狗脊炮制品粉末顏色，討論微波炮制過程中2 種指標成分含有量與粉末顏色變化的關聯性，以期為狗脊微波炮制過程的監測及炮制品的質量評價提供依據。

1 材料

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；KQ-500DE 數控超聲機清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E 分析天平（萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；Sartorius-CP225D 分析天平（十萬分之一，上海精密科學儀器有限公司）；AR852B＋型紅外測溫儀（東莞萬創電子制品有限公司）；EG823MF3-NW 微波爐（美的集團有限公司）；XDW-C260S 不銹鋼破碎機（濟南達微機械有限公司）；CANON EOS 77D 照相機（日本佳能株式會社）。

對照品原兒茶酸（批號110809-200604）、5-羥甲基糠醛（批號111626-201711） 均購自中國食品藥品檢定研究院。

狗脊藥材采自湖南湘西龍山冼洛鄉，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz（L.） J.sm.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 狗脊炮制品制備

2.1.1 傳統砂燙炮制 根據2015 年版《中國藥典》 中方法，取生狗脊片，照砂燙法操作，將潔凈河砂置炒制容器內，用武火加熱至滑利狀態時（紅外測溫儀測定溫度為200℃），投入生狗脊片，不斷翻動，砂燙至表面鼓起、顏色為棕褐色時，取出，篩去河砂，放涼，除去殘存絨毛。

2.1.2 微波炮制 取大小、厚薄均勻的狗脊飲片，適當破碎，過3.0 cm 篩網。選取大小相同的狗脊碎塊，共15 份，每份約50 g，置于托盤內，于500 W（中高火） 功率下進行微波炮制，炮制時間分別 為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28 min，同時采用紅外測溫儀測定樣品取出時的溫度。

2.2 含有量測定

2.2.1 色譜條件 安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈-1% 冰醋酸溶液（5∶95）；體積流量0.8 mL／min；柱溫30℃；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。理論塔板數按原兒茶酸計算，不低于3 000，色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 取原兒茶酸對照品和5-羥甲基糠醛對照品適量，精密稱定，加甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30） 制成每1 mL 含100 μg 原兒茶酸、30 μg 5-羥甲基糠醛的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末（過3 號篩） 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30） 25 mL，稱定質量，超聲（250 W，40 kHz） 處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30） 補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 線性關系考察 分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別吸取上述混合對照品溶液各10 μL，在“2.2.1” 項色譜條件下測定。以各成分峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.2.5 精密度試驗 分別精密吸取上述原兒茶酸和5-羥甲基糠醛混合對照品溶液10 μL，在“2.2.1” 項色譜條件下連續進樣5 次，得原兒茶酸和5-羥甲基糠醛對照品溶液峰面積RSD 分別為0.178%、0.230%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗取燙狗脊粉末1 g，按“2.2.3” 項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.2.1” 項色譜條件下，分別于0、6、12、18、24、30、36 h 進樣，得原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量RSD 分別為0.343%、0.669%，表明供試品溶液在36 h 內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批號燙狗脊藥材，按“2.2.3” 項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣，測得原兒茶酸和5-羥甲基糠醛的含有量 RSD 分別為 1.89%、1.61%，表明該方法重復性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 炮制品粉末色度值測定

2.3.1 色度值采集方法 取狗脊不同炮制品，粉碎，95%以上過4 號篩，無法過篩粉末與已過篩粉末混合。以國際照明委員會認可的D65 光源作為光源［11］，白色作為背景，對炮制飲片粉末圖像進行采集。

2.3.2 精密度試驗 取同一燙狗脊飲片粉末，按“2.3.1” 項下方法測定，連續測量顏色6 次，結果測得值的RSD 為3.51%，表明該方法精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一燙狗脊飲片粉末，按“2.3.1” 項下方法測定，分別于1、4、6、8、12 h 測量其色度值，結果顯示測得值的RSD 為3.25%，表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 按“2.3.1” 項下方法測定，分別制備6 份狗脊粉末，測量其色度值，結果顯示測得的RSD 為3.91%，表明該方法重復性良好。

2.4 樣品含有量測定 取狗脊不同炮制品粉末，以國際照明委員會認可的D65 光源作為光源，白色作為背景，對炮制飲片粉末圖像進行采集，采用Adobe Photoshop 6.0 軟件讀取飲片粉末的色度值（L、a、b），平行測定3 次，取平均值，測定結果見表2。

表2 狗脊微波炮制過程中指標成分含有量及粉末色度值變化Tab.2 Changes of index composition content and powder color quantification value during microwave processing of C.baronetz

圖2 顯示，隨著微波炮制時間的延長，溫度逐漸升高，炮制4～16 min 過程中原兒茶酸的含有量逐漸升高，16 min 之后開始下降，可能由于原兒茶酸在炮制過程中存在雙向轉化：生品中原兒茶酸-3-O-糖苷受熱分解為原兒茶酸和糖，同時原兒茶酸受熱又分解為其他物質［12-13］。

圖2 各成分隨溫度的變化Fig.2 Variation of various constituents with temperature

炮制4～8 min 過程中，溫度升高明顯，原兒茶酸的生成速率大于原兒茶酸分解速率，原兒茶酸含有量上升；炮制8～16 min 過程中，溫度變化較小，原兒茶酸的生成與分解逐漸達到動態平衡，此時原兒茶酸含有量最高；炮制16～24 min 過程中，燙狗脊表面鼓起裂開，游離水分減少，溫度迅速升高，原兒茶酸的生成速率小于原兒茶酸分解速率，原兒茶酸含有量下降。

燙狗脊中5-羥甲基糠醛是由果糖脫水而成［14］，而5-羥甲基糠醛具有一定的揮發性，炮制前期，生成速率大于揮發速率，含有量上升；14 min 后，隨著溫度升高，揮發速率大于生成速率，含有量下降。炮制過程中化學成分變化見表3。

結果表明狗脊微波炮制品在6～16 min 之內表面鼓起或輕微裂開、外觀顏色呈淺棕褐色或棕褐色，原兒茶酸含有量不低于0.2 mg／g，飲片的性狀變化，指標成分含有量均符合藥典要求，且與傳統砂燙制品接近。

表3 狗脊炮制過程中化學成分變化Tab.3 Change of chemical constituents in the processing of C.baronetz

2.5 關聯性分析 微波炮制過程中，燙狗脊表面微鼓起、棕褐色、產生刺激性氣味等現象與傳統砂燙炮制過程基本一致。隨著炮制時間延長，溫度逐漸升高，在6 min 時溫度達到151℃，開始出現狗脊炮制過程中特有的刺激性氣味；在10 min 時溫度達到197℃，金色絨毛開始脫落并出現灰色煙霧，隨著時間延長逐漸濃烈，此時微波爐內壁有黑褐色附著物。由于狗脊含揮發油成分較高［15］，刺激性氣味可能是揮發油成分揮發產生，而黑褐色附著物則可能是狗脊絨毛焦屑隨揮發油成分揮發而成。

由于微波炮制16 min 后，燙狗脊表面鼓起裂開，溫度升高，水分減少，內部開始灰化，且隨微波時間的延長，灰化程度逐漸嚴重，已不滿足炮制品的性狀要求。綜合考慮，選取16 min 內的試驗數據進行分析。采用SPSS 20.0 軟件分析微波炮制過程中狗脊各指標成分含有量與色度值的關聯性，以原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量為自變量（X），L，a和b為因變量（Y），進行多元線性回歸，結果見表4。

表4 含有量與色度值相關分析Tab.4 Correlation analysis between the content of furfural and chromaticity value

相關性分析結果表明，原兒茶酸、5-羥甲基糠醛含有量與色度值a 有較強相關性（r＞0.8）；原兒茶酸、5-羥甲基糠醛含有量與色度值L 有一定的相關性（r＞0.7）。因此，色度值可作為狗脊微波炮制過程中監測炮制品質量評價的依據。

3 討論

微波炮制的原理是利用高頻電磁波以一定的高頻率振蕩穿透物品，使物品內的極性分子被吸引共振，從而相互碰撞產生大量的熱量，并在藥材的內外同時發生發熱過程，最終達到炮制的目的，這種新型炮制方法相較傳統砂燙法，具有更加節能、操作簡單、清潔、勞動強度小等優點。研究發現，整塊狗脊并不適用于微波炮制，大小、薄厚等因素均會嚴重影響炮制的均勻性，故本研究在微波炮制時選用了先破碎，再篩選大小、薄厚均勻的狗脊碎塊進行炮制。

傳統的飲片炮制主要通過操作者眼看、鼻聞、手捻等感官經驗判斷炮制終點，該方式存在較大的主觀性，易導致批間差異，適用性不高。1976 年，由CIE組織提出的LAB 色度空間理論，使樣品顏色可量化［16］。近年，該理論被引入中藥領域，為中藥飲片的質量標準提供新的方向。本研究采用照相機獲取狗脊炮制品的表觀顏色信息，通過Adobe Photoshop 6.0 軟件處理，使狗脊炮制品的外觀顏色量化。通過對炮制樣品進行統計學分析發現，不同時間炮制品間色度值和原兒茶酸、5-羥甲基糠醛含有量間具有一定的關聯性，代表明暗的L、代表燙狗脊特征顏色灰褐色的a 與5-羥甲基糠醛含有量均顯著相關。

有研究表明［17］，狗脊炮制過程中原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量均先增加后減少，但5-羥甲基糠醛相較于原兒茶酸對溫度更加敏感。炮制過程中5-羥甲基糠醛含有量變化大于原兒茶酸，但目前大多數文獻和標準中僅以原兒茶酸含有量作為燙狗脊及其炮制品的質量評價指標。研究表明生脈散中的5-羥甲基糠醛成分具有抗氧化、保護肝組織、改善血液微循環等作用，其可能是“益氣生脈” 的物質基礎［18］，但《中國藥典》 中，對葡萄糖注射液的質量檢測時，5-羥甲基糠醛被當作有害物質加以限量控制，因此，需結合藥理學研究結果，綜合考量5-羥甲基糠醛的含有量用以評價燙狗脊的質量。

本研究以原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量為評價指標，考察狗脊微波炮制過程中指標成分含有量與粉末色度值的相關性，以期為其他中藥飲片的炮制提供參考。