根皮素磷脂復合物的制備及其體內藥動學研究

馬記平 劉丹花 郝海軍 李曉蒙 王 利 范明松*

（1.鄭州澍青醫學高等專科學校， 河南 鄭州450064； 2.上海雷允上藥業有限公司技術中心， 上海201401）

根皮素是一種含有二氫查爾酮結構的黃酮類植物多酚，主要存在于蔬菜及梨、蘋果等水果的根莖中，具有抗菌、抗糖尿病、抗氧化、抗腫瘤、雌激素樣作用等多種藥理活性［1-3］，此外還具有美白肌膚、延緩衰老、祛除粉刺等多種美容功效［4］。但該成分溶解度很差［5］，口服給藥后很難被吸收［6］，目前已有固體分散體［7］、包合物［8］等制劑學方面的研究，但尚無磷脂復合物制劑技術的報道。

磷脂復合物是藥物分子和磷脂或磷脂酰膽堿分子之間通過氫鍵、范德華力等作用力而形成的一種復合物［9-12］，其基本理化性質不同于原型藥物，可改變藥物晶型狀態［13］，增加其溶解度，促進其口服吸收。本實驗采用單因素試驗優化根皮素磷脂復合物處方，對其進行表征，并考察其生物利用度。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器、自動進樣器（美國Agilent 公司）；MSE125P-CE型電子天平（德國Sartorius 公司）；CJ-78-1A型磁力攪拌器（上海躍進醫療器械廠）；D8型X 射線粉末衍射儀（瑞士Bruker 公司）；THZ-92A型恒溫振蕩器（上海翠柳實驗儀器有限公司）；QT-2A型旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；KL152型氮氣吹掃儀（滁州精鑫實驗儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 根皮素對照品（批號P7912，純度99.9%，美國Sigma 公司）；巖白菜素對照品（批號477-90-7，純度99.2%，上海源葉生物科技有限公司）；卵磷脂（批號PC-98T，上海輔必成醫藥科技有限公司）。四氫呋喃為色譜純（批號C10303495，德國Merck 公司）；正辛醇（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 動物 SD 大鼠，雌雄兼用，體質量（300±20） g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（滬） 2013-0016。

2 方法與結果

2.1 根皮素含有量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1% 氨水（35∶ 75）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25℃；檢測波長285 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 取根皮素磷脂復合物10 mg，加入10 mL 石油醚溶解，過0.22 μm 微孔濾膜后揮去石油醚，加入50 mL 乙腈重新溶解，即得。

2.1.3 方法學考察 稱取根皮素對照品20.0 mg，溶于100.0 mL 乙腈中，得200.0 μg／mL 貯備液，精密量取5 mL置于10 mL 量瓶中，乙腈-0.1% 氨水混合液（35∶75） 定容至刻度，得到100.0 μg／mL 溶液，進一步稀釋成1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg／mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝1.355 6X＋4.013 8（r＝0.999 9），在1.0～100.0 μg／mL 范圍內線性關系良好。

取100.0、50.0、1.0 μg／mL 對照品溶液，同一天在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得日內精密度RSD 分別為0.13%、0.09%、0.19%；每天進樣測定1 次，共6 d，測得日間精密度RSD 分別為0.24%、0.19%、0.75%。取“2.1.2” 項下供試品溶液，于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得根皮素含有量RSD 為0.79%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。取大豆磷脂約7.5 mg，按“2.1.2” 項下方法平行制備供試品溶液9 份，分為3組，分別加入標示量80%、100%、120%水平的對照品溶液，每個水平平行3 份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得根皮素平均加樣回收率為99.53%，RSD 為1.60%。

2.2 磷脂復合物制備 稱取處方量大豆卵磷脂、50 mg 根皮素（45℃下真空干燥12 h） 置于圓底燒瓶中，加入50 mL四氫呋喃后得混懸液，恒溫攪拌一定時間后減壓旋蒸除去四氫呋喃，收集殘留物，45℃下真空干燥12 h，即得。

2.3 復合率測定 取根皮素（總量m0） 與適量大豆卵磷脂制成磷脂復合物，加入10 mL 石油醚溶解，過0.22 μm微孔濾膜除去游離藥物，揮去石油醚，加10 mL 乙腈重新溶解，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得形成磷脂復合物所需藥量（m1），計算復合率，公式為復合率＝（m1／m0） ×100%。

2.4 制備工藝優化

2.4.1 大豆磷脂用量 固定根皮素用量為50 mg，四氫呋喃用量為40 mL，制備溫度為45℃，制備時間為4 h，考察大豆磷脂用量130、140、150、160、170 mg 對復合率的影響，結果見圖1。由此可知，隨著大豆磷脂用量逐漸增加，復合率也逐漸升高，在160 mg 時最大（93.17%），故確定為160 mg。

圖1 大豆磷脂用量對復合率的影響

2.4.2 制備溫度 固定根皮素用量為50 mg，四氫呋喃用量為40 mL，制備時間為4 h，大豆磷脂用量為160 mg，考察制備溫度25、35、45、55、65℃對復合率的影響，結果見圖2。由此可知，隨著制備溫度逐漸升高，復合率也逐漸升高，但在65℃時反而下降，可能是由于大豆磷脂在溫度較高時氧化變質所致，故確定為55℃。

圖2 制備溫度對復合率的影響

2.4.3 制備時間 固定根皮素用量為50 mg，四氫呋喃用量為40 mL，制備溫度為55℃，大豆磷脂用量為160 mg，考察制備時間2.5、3、3.5、4、4.5、5 h 對復合率的影響，結果見圖3。由此可知，隨著制備時間延長，復合率也逐漸升高，但在4 h 后有所下降，可能與時間過長導致大豆磷脂氧化變質有關，故確定為4 h。

圖3 制備時間對復合率的影響

2.4.4 溶劑體積 固定根皮素用量為50 mg，制備時間為4 h，制備溫度為55℃，大豆磷脂用量為160 mg，考察溶劑（四氫呋喃） 體積20、25、30、35、40、45 mL 對復合率的影響，結果見圖4。由此可知，隨著溶劑體積逐漸增加，復合率也逐漸升高，在40 mL 時最大，可能是因為此時藥物、磷脂濃度下降，有利于增加2 種分子結合的機會，故確定為40 mL。

圖4 溶劑體積對復合率的影響

2.5 存在狀態研究 采用XRPD 對根皮素在磷脂復合物中的存在狀態進行研究，掃描范圍（2θ） 3°～45°，掃描速度8°／min，電流40 mA，Cu-Kα 靶，結果見圖5。由此可知，根皮素在3°～30°范圍內有多處典型晶型峰，它與大豆卵磷脂簡單制備的物理混合物中可見其晶型峰，磷脂復合物中兩者特征晶型峰均消失，可能是因為它們形成磷脂復合物后各自極性端發生某種定性結合所致，同時也證明磷脂復合物并不是簡單的物理混合。另外，由于大豆磷脂XRPD峰強度遠遠低于根皮素，兩者制成物理混合物后后者XRPD 特征峰掩蓋了前者，導致物理混合物中幾乎未體現磷脂特征峰。

圖5 各樣品XRD 圖譜

2.6 溶解性能分析 取根皮素、物理混合物、磷脂復合物，加入蒸餾水（經正辛醇飽和） 或正辛醇（經蒸餾水飽和），25℃、800 r／min 磁力攪拌48 h，取適量混懸 液8 000 r／min離心15 min，取上清液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算表觀溶解度，結果見表1。由此可知，磷脂復合物在正辛醇、水中的表觀溶解度分別較原料藥提高4.74、2.62 倍，差異有統計學意義（P＜0.01），與磷脂復合物技術可同時改善難溶性藥物脂溶性、水溶性的報道相符。

表1 各樣品表觀溶解度測定結果（， n＝3）

表1 各樣品表觀溶解度測定結果（， n＝3）

注：與根皮素比較，**P＜0.01。

2.7 體內藥動學研究

2.7.1 灌胃供試液制備 取根皮素、物理混合物、磷脂復合物適量，置于0.5% CMC-Na 溶液中，超聲分散，即得（15 mg／mL，以根皮素含有量計）。

2.7.2 給藥及取血 取Wistar 大鼠18 只，自然晝夜光線照明，隨機分為3組，灌胃給藥前禁食12 h，不禁水。各組大鼠均按100 mg／kg 劑量灌胃給予根皮素、物理混合物、磷脂復合物0.5% CMC-Na 混懸液，于0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 各取血約0.3 mL，保存于肝素浸潤的離心管中，2 500 r／min 離心3 min，上清液保存于冰箱冷凍室中。

2.7.3 樣品處理 取血漿、內標溶液（400 ng／mL） 各100 μL，混勻后加入1.5 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻3 min，10 000 r／min 離心8 min，上清液于50℃氮氣中吹干，100 μL 乙腈復溶，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.7.4 線性關系考察 稱取巖白菜素對照品10.0 mg，溶于50 mL 乙腈中，得200 μg／mL 貯備液，精密量取1.0 mL于100 mL 量瓶中，乙腈定容至2 000 ng／mL，精密量取2.0 mL于10 mL 量瓶中，乙腈定容，得400 ng／mL 內標溶液。

取上述貯備液，乙腈逐步稀釋成1 500、750、500、100、50、20 ng／mL，各取500 μL，加入500 μL 內標溶液，50℃氮氣緩慢吹干后加入500 μL 空白血漿，按“2.7.3”項下方法處理。以溶液質量濃度為橫坐標（X），根皮素與內標峰面積比值為縱坐標（Y） 進行回歸，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，得方程為Y＝1.368 4X＋9.745 1（r＝0.992 3），在20～1 500 ng／mL 范圍內線性關系良好，定量限（S／N＝10） 為8.0 ng／mL，檢測限（S／N ＝3） 為3.5 ng／mL。

2.7.5 方法學考察 取空白血漿、血漿對照品溶液（加根皮素對照品、內標）、血漿樣品（加內標），按“2.6.3”項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，發現內源性物質不干擾根皮素、內標測定，表明該方法專屬性良好。取20、750、1 500 ng／mL 血漿對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得峰面積RSD 分別為3.11%、3.92%、2.88%，表明該方法重復性良好。每天在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定1 次，連續6 d，測得峰面積RSD 分別為11.06%、6.75%、4.01%，表明儀器精密度良好。取磷脂復合物灌胃給藥1 h 的血漿樣品，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得峰面積RSD 為8.69%，表明溶液在48 h 內穩定性良好。取上述3 種質量濃度血漿對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得平均加樣回收率分別為91.01%、88.74%、97.05%，RSD 均小于6.96%。

2.7.6 實驗結果 圖6、表2 顯示，原料藥、物理混合物之間藥動學參數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與原料藥、物理混合物比較，磷脂復合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），tmax有所延長，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與原料藥比較，磷脂復合物的相對生物利用度提高至2.29 倍。

圖6 各樣品血藥濃度-時間曲線

3 討論

本實驗通過單因素實驗，確定根皮素磷脂復合物最優處方為根皮素用量50 mg，大豆磷脂用量160 mg，制備時間4 h，制備溫度55℃，四氫呋喃體積40 mL，其中根皮素與大豆磷脂比例為1∶1.19。課題組前期曾以大豆磷脂用量（150、160、170 mg）、制備時間（3.5、4、4.5 h）、制備溫度（50、55、60℃）、四氫呋喃體積（35、40、45 mL） 為影響因素設計正交試驗作進一步優化，發現所得最優工藝與單因素試驗一致（限于篇幅，不再展示相關數據），但方差分析顯示制備時間有極顯著差異（P＜0.01）。

表2 各樣品主要藥動學參數（， n＝6）

表2 各樣品主要藥動學參數（， n＝6）

注：與根皮素比較，＃＃P＜0.01；與物理混合物比較，ΔΔP＜0.01。

難溶性藥物分子與磷脂分子形成磷脂復合物后，前者水溶性和脂溶性均得到提高，以脂溶性更明顯，有利于其穿透過胃腸道黏膜。由于磷脂復合物中磷脂與胃腸道黏膜的高親和性，在磷脂轉換蛋白的協助下藥物分子與細胞膜結合、交換而順利進入機體血液循環［14-15］，最終提高難溶性藥物口服吸收生物利用度。藥動學研究結果表明，根皮素磷脂復合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞與原料藥混懸液相比差異均具有統計學意義（P＜0.01），相對生物利用度提高至2.29 倍；物理混合物三者有所升高，可能與磷脂本身具有一定的促吸收作用有關，但藥動學參數無明顯差異（P＞0.05）。

由于根皮素在化妝品領域也具有較好的應用前景，今后可對其透皮吸收進行研究［16-17］。大量研究結果顯示，磷脂復合物可作為制劑中間體（如磷脂復合物固體分散體［18］、磷脂復合物固體脂質納米粒［19］、磷脂復合物納米結構脂質載體［20］等），而本實驗制備的根皮素磷脂復合物也可為后續研究奠定基礎［21］。