肺纖方提取工藝的優化

劉 藝朱啟勇諶曉莉肖慶齡*鞠建明*

（1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院， 江蘇 南京210028； 2.江蘇省中醫藥研究院， 江蘇 南京210028）

中藥復方具有多成分、多靶點、協同發揮療效的特點，在研究其提取工藝的過程中傾向于采用能反映整體提取效果的指標，而不是某一種或一些指標成分［1-2］。指紋圖譜作為一種綜合、整體、可量化的定性定量分析手段，能較好地體現復方制劑中各類成分與療效的相關性，國內外主要將其用于成分分析和質量控制研究［3-10］。由于中藥復方提取物成分復雜、各成分權重系數難以確定，故需要結合統計學方法進行綜合評價。主成分分析常被應用于綜合評價［11-12］，基于其方差最大原則，把數據中的自變量進行歸一化處理，減少相互重疊信息，即降維思想，同時將多指標轉化為少數相互獨立的綜合指標，用于反映大部分信息。肺纖方為江蘇省中西醫結合醫院全國名老中醫朱啟勇主任的臨床驗方，由丹參、赤芍、桃仁、水蛭、麥冬、木蝴蝶等藥材組成，具有補肺腎陰、化肺絡瘀之功效，臨床上用于治療陰虛血瘀引起的肺間質纖維化，在常規治療基礎上聯合其治療時可使動脈血氣、肺功能、癥狀積分明顯改善，療效顯著。但該方劑型為湯劑，患者使用不便，故擬按照醫院制劑備案技術要求，在物質基礎不發生改變的前提下將其開發為顆粒劑。本實驗遵循中醫傳統采用水提取方法，依據中藥復方制劑整體性的特點，將指紋圖譜技術與主成分分析相結合優化肺纖方提取工藝，以期將該方開發成醫院制劑、服務廣大患者奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Waters 高效液相色譜儀，配置Alliance 2695 四元泵、自動進樣系統、2996 二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；Milli-Q型純水器（美國Millipore 公司）；AT201型電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Buchi-200 旋轉蒸發儀（瑞士Buchi 公司）。

1.2 試劑與藥物 丹參（批號20180401-04） 購自貴州同德藥業有限公司；水蛭（批號170824） 購自南京松齡中藥飲片有限公司；桃仁（批號1708010）、赤芍（批號1802003）、麥冬（批號1804011） 購自亳州市萬珍中藥飲片廠；木蝴蝶（批號20170724） 購自南京松齡中藥飲片有限公司，均由江蘇省中醫藥研究院錢士輝研究員鑒定為正品，符合2015 版《中國藥典》 一部相關規定。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取液制備 稱取方中各味藥材共9 份，每份含藥量為114 g，置于圓底燒瓶中，按照表1 因素水平回流提取后，考察料液比（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C） 對提取效果的影響，合并后濃縮至500 mL，冷藏備用。

表1 因素水平

2.2 供試品溶液制備 精密吸取 “2.1” 項下提取液5 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，超聲（功率250 W） 處理30 min，放冷，定容后搖勻，12 000 r／min離心10 min，即得。

2.3 色譜條件奧泰AlltimaTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫（0～20 min，2%～3% 乙腈；20～21 min，3%～6% 乙腈；21～41 min，6%～14%乙腈；41～71 min，14%～27%乙腈；71～86 min，27%～45% 乙腈）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35℃；檢測波長283 nm；進樣量10 μL。

2.4 精密度試驗 按照2015 年版《中國藥典》 方法進行考察，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得33個共有峰保留時間RSD 為0.04%～1.48%，峰面積RSD 為0.32%～1.95%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗 按照2015 年版《中國藥典》 方法進行考察，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得33個共有峰保留時間RSD 為0.63%～2.66%，峰面積RSD 為0.02%～1.22%，表明該方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗 按照2015 年版《中國藥典》 方法進行考察（24 h 內），在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得33個共有峰保留時間RSD 為0.15%～1.36%、峰面積RSD為0.54%～2.98%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 HPLC 指紋圖譜建立 精密吸取9 份“2.2” 項下供試品溶液，每份10 μL，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A 版）對所得結果進行分析，采用中位數法生成對照指紋圖譜（R），共標定33個共有峰，見圖1。

圖1 9 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.8 共有色譜峰的標識及歸屬分析 精密稱取方中處方量藥材（水蛭主要包含蛋白質和氨基酸，故未對其進行檢測），置于圓底燒瓶中，加12 倍量水回流提取2 次，每次60 min，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣10 μL 測定，記錄色譜圖，確認共有峰藥材歸屬，結果見圖2。確認了28個共有峰的來源，分別來自丹參（10、16、17、25、30、32 號峰）、麥冬（7、18、19、20 號峰）、赤芍（1、2、3、5、24、26 號峰）、桃仁（9、14、15 號峰）、木蝴蝶（11、13、14、21、27、28、29、31、33 號峰）。

圖2 肺纖方及組成藥材的HPLC 色譜圖

2.9 數據處理

2.9.1 主成分分析 將表1 數據錄入SPSS 22.0 軟件進行因子分析，得到可以代表原始峰面積的主成分、貢獻率及解釋的總方差，見表2。主成分個數的提取原則為篩選特征值大于1 者［13］，故前6 種成分的初始特征值分別為17.678、5.876、3.606、2.539、1.477、1.073，方差貢獻率分別為 53.569%、17.807%、10.927%、7.694%、4.477%、3.251%，累積方差貢獻率為97.725%，包含了大部分相關信息。

將第1～3 主成分作為變量，建立三維投影圖載荷圖（圖3），在投影圖中距離原點較遠的點為權重較大的成分。在第1、第2 主成分中，峰1～6、8～18、20、22、25～26、30～31、33 的系數較大，可反映上述色譜峰的相關信息；同理，第3 主成分主要反映了峰7、23 的相關信息。

圖3 各主成分載荷圖

表2 各主成分總方差

2.9.2 正交試驗分析 以提取指紋圖譜共有峰主成分所得綜合評分（F） 為評價指標，主成分得分＝主成分因子得分× 相應方差算數平方根［14］，即F＝0.535 69F1＋0.178 07F2＋0.109 27F3＋0.076 94F4＋0.044 77F5＋0.032 51F6；料液比（A）、提 取時間（B）、提取次數（C） 為影響因素，正交試驗優化提取工藝，結果見表3，方差分析見表4。

表3 試驗設計與結果

表4 方差分析

由表3 可知，各因素影響程度依次為A＞B＞C，理論最優工藝為A3B3C3；由表4 可知，各因素均無顯著影響（P＞0.05）。綜合考慮時間、成本等各方面因素，最終確定最優工藝為A3B2C2，即加12 倍量水提取2 次，每次60 min。

2.9.3 驗證試驗 根據處方比例稱取3 份藥材，按“2.8.2” 項下優化工藝提取，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，計算各共有峰面積主成分綜合評分，結果見表5。由此可知，工藝穩定可行，可用于工業化生產。

表5 驗證試驗結果（n＝3）

3 討論

中藥復方發揮藥效的關鍵，在于其多成分、多靶點的協同作用。因此，在選擇中藥復方最優提取工藝的過程中，如果只選用某一或某幾種成分的含有量作為評價指標，則無法反映全方整體提取水平。

指紋圖譜是一種評價中藥復雜成分體系質量標準的有效手段，能較好地反映其整體上的相近程度，包括以峰面積、相對保留時間、相對峰面積為指標進行定性和半定量分析，在中藥復方提取工藝優化中具有一定優勢［15］。本實驗比較了不同梯度甲醇-水、乙腈-水的分離效果，確定文中色譜條件；通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（A版） 對9 批樣品HPLC 指紋圖譜進行分析，得到對照指紋圖譜（R） 及33個共有峰，并將其作為提取工藝優化指標。方法學研究結果顯示，本實驗所建立的方法具有良好的精密度、穩定性、重復性，可用于指標成分定量分析。

考慮到各組分權重系數難以確定，本實驗采用主成分分析，將高維數據降到低維，把33個共有峰組合成6個涵蓋了原始色譜峰97.725%信息的綜合指標，從而較好地濃縮、簡化數據，為進一步正交試驗極差分析和方差分析奠定基礎。

綜上所述，本實驗建立了肺纖方HPLC 指紋圖譜，并與主成分分析等化學計量學方法相結合，用未知結構成分的模糊數據（特征色譜峰的總因子得分） 進行多指標的綜合評定，從而優化該方提取工藝。該方法既全面反映了藥材整體提取水平，又在數據處理方面簡單易行，具有較好的實用性和借鑒意義。