金露梅在酪氨酸酶催化中的抑制機理

李曉雯 王春麗

（華東理工大學藥學院， 制藥工程與過程化學教育部工程研究中心， 上海市新藥設計重點實驗室， 上海200237）

酪氨酸酶即多酚氧化酶，常見于人體和動、植物體內，微生物中也能見到［1］，對黑色素代謝、兒茶酚胺有很大影響，能在一定程度上限制其代謝速度［2］。在酪氨酸酶單酚酶的刺激下，酪氨酸會發生羥化反應，生成鄰位二羥基苯丙氨酸（L-多巴），而在二酚酶作用下后者會發生氧化反應，生成多巴醌，繼續發生反應后就會形成黑色素［3］。因此，只要在酪氨酸酶發生反應的過程中抑制其活性，就可減少黑色素的形成，從而達到美白效果。

金露梅Potentilla fruticosaL.是薔薇科委陵菜屬灌木類植物［4］，為西藏常見藥物，因其生長環境的溫差較大、海拔較高、日照時間較長，其成分組成多樣，活性極強［5］，包括黃酮類、三萜類、多糖類、鞣質、醌類等［6］。多酚作為一種廣泛應用于美白產品的酪氨酸酶抑制劑，既可與底物競爭，結合酪氨酸酶，也可抑制酶反應活性，從而減少黑色素生成以達到美白祛斑的作用［7］。目前，對金露梅總多酚含有量及其抑制酪氨酸酶活性的報道較少［8］，故本實驗考察該植物在酪氨酸酶催化中的抑制機理，以期為相關美白產品的研發提供科學根據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 金露梅采自西藏，經華東理工大學馬磊副教授鑒定為正品。酪氨酸酶（美國Worthington 公司，1 080 U／mg）；L-多巴、L-酪氨酸對照品［阿拉丁試劑（上海） 有限公司］。無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器 JY5002 電子天平（上海復平儀器儀表有限公司）；WK-400B 高速藥物粉碎機（山東精誠機械有限公司）；SHZ-3 循環水多用真空泵、HH-WO 電子恒溫水浴鍋（上海予華儀器有限公司）；PS-30AL 超聲波清洗儀（深圳市潔康有限公司）；UV1900 紫外分光光度計（上海奧譜勒儀器有限公司）。

2 方法

2.1 總多酚制備與含有量測定

2.1.1 提取 稱取金露梅全株5.0 g，粉碎處理后以30目篩進行篩選，置于錐形瓶中，加入100 mL 50%乙醇，50℃下超聲提取30 min，得到粗提物，60℃下減壓蒸餾除去乙醇，置于100 mL 量瓶中定容，即得金露梅總多酚提取物，質量濃度為50 g／L［9］。

2.1.2 分離純化 采用HZ-828 大孔樹脂，5 g／L 提取液以1.0 mL／min 體積流量上樣50 mL，進行動態吸附，50 mL 70%乙醇進行動態洗脫，洗脫液減壓蒸餾濃縮，即得純化物［10］。

2.1.3 定量測定 采用福林酚測定法［11］。精密稱取10 mg沒食子酸對照品，離子水溶解并定容至100 mL，得0.1 mg／mL 溶 液，取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于25 mL 量瓶中（終質量濃度分別為4、6、8、10、12、14、16 μg／mL），加入1 mL 福林酚試劑、2 mL 10%Na2CO3試劑，搖勻定容，25℃下反應1 h 后，測定其在最大吸收波長765 nm 波長處的吸光度（A765）。以溶液質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A） 進行回歸，得到方程 為A＝0.131 3X-0.008 4（R2＝0.999 1），在0～16 μg／mL范圍內線性關系良好。

將“2.1.2” 項下純化物在60℃下通過減壓蒸餾除去乙醇，去離子水定容至5 g／L，取1.0 mL，去離子水定容于10 mL 量瓶中，再量取0.5 mL 于25 mL 量瓶中，依次加入1 mL 福林酚試劑、2 mL 10% Na2CO3溶液，混勻，定容，2 5℃下反應1 h 后，測定A765。

結果，金露梅純化后總多酚含有量為171.13 mg／g，終藥液濃度為10 μg／mL。

2.2 酶活性測定 對酪氨酸酶活性進行檢測的前提是多巴色素最大吸收峰在475 nm 波長處，而多巴色素來自于酪氨酸、L-多巴的酶催化氧化反應［12］。酪氨酸酶反應活性定義［13］為以每1 min 多巴色素在475 nm 波長處的吸光度（A475） 增加0.001，為1個酶活性單位，即1 U／min，可依據酶催化反應系統A475伴隨時間的增長，得到對應的酶活性值。

2.2.1 單酚酶活性 參考文獻［14］報道。以1.5 mmol／LL-酪氨酸為底物，在反應系統內依次加入3.1 mL 磷酸緩沖液（pH＝6.8）、1.5 mL 5.0 mmol／LL-酪氨酸（溶于pH ＝6.8 磷酸鹽緩沖液中），在28℃恒溫水浴鍋中恒溫10 min，依次加入0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物各0.2 mL 及酪氨酸酶溶液0.2 mL，搖晃均勻后迅速置于紫外分光光度計中，在475 nm 波長處每30 s 讀取1 次吸光度，連續15 min。在該反應體系中，酶終質量濃度為20 mg／L。

2.2.2 二酚酶活性 參考文獻［15］報道。以1.0 mmol／LL-多巴為底物，在此反應體系內依次加入3.6 mL 磷酸緩沖液（pH＝6.8）、1.0 mL 5.0 mmol／LL-多巴（溶于pH ＝6.8磷酸鹽緩沖液中），在28℃恒溫水浴鍋中恒溫10 min，依次加入0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物各0.2 mL 及酪氨酸酶溶液0.2 mL，搖晃均勻后迅速置于紫外分光光度計中，在475 nm 波長處每30 s 讀取1 次吸光度，連續15 min。在該反應體系中，酶終質量濃度為4.0 mg／L。

2.2.3 計算方法 公式為相對酶活性＝［（A2-A1）／（A4-A3）］×100%，其中A1、A2分別為底物、酪氨酸酶與金露梅提取物溶液在一定時間段內（單酚酶活性5～10 min，二酚酶活性0～6 min） 對應的吸光度；A3、A4表示存在前2 種物質，但不存在金露梅提取物體系在1個時間間隔內的前后吸光度，時間段選擇一致［16］。

2.3 金露梅對酪氨酸酶二酚酶活性抑制機理的分析 固定酪氨酸酶活性為66 U／mL，在反應體系內依次加入磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）、L-多巴溶液、金露梅50%乙醇提取物各1 mL，置于水浴鍋中，28℃下恒溫10 min，再加入1 mL酪氨酸酶溶液，搖晃均勻迅速置于紫外分光光度計中進行檢測。改 變L-多巴溶液濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol／L，測定0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物A475，計算初速度V0，繪制濃度-初速度曲線。再利用Lineweaver-Burk 雙倒數方程，由底物L-多巴溶液濃度、V0倒數為指標作圖，測得米氏常數Km、酶促反應最大速率Vm，用來判斷其抑制種類［17］。

以Lineweaver-Burk 雙倒數方程直線斜率、截距為縱坐標，提取物溶液質量濃度為橫坐標再繪圖，得到對應的抑制常數KI、KIS［18］。V0-1＝Km·Vm-1（1＋CI·KI-1）CS-1＋Vm-1（1＋CI·KIS-1），其中V0為初速度，單位A／min；Km為米氏常數，單位mmol／L；Vm為最大反應速率，單位A／min；CI為金露梅提取物質量濃度，單位g／L；CS為底物濃度，單位mmol／L；KI為金露梅提取物與酶的反應常數，單位g／L；KIS為金露梅提取物和酶-底物絡合物發生反應的常數，單位g／L［19］。

3 結果

3.1 金露梅提取物對酪氨酸酶單酚酶活性的影響 在單酚酶活性測定時使用酪氨酸酶，通常情況下能減緩其催化反應而出現遲滯時間，同時在反應系統中酶、底物濃度能影響延遲時間［20］。按“2.2” 項下方法測定A475，金露梅提取物對酪氨酸酶單酚酶作用的進程曲線見圖1。由此可知，單酚酶活性存在遲滯時間（曲線的直線部分交于橫坐標的值）［21］，在反應系統內提取物可讓其活動延遲時間增加，而且質量濃度越高，延遲時間越長，曲線斜率減小，即穩態酶活性下降，表明它可在一定程度上抑制酪氨酸酶單酚酶的活性，縮減其效用。

金露梅提取物存在濃度差異時，會對酪氨酸酶催化氧化反應有影響，從而改變其L-酪氨酸的穩態酶活性（即5～10 min的相對酶活性）。圖2 顯示，隨著提取物溶液質量濃度升高，穩態酶活性降低，IC50約為3.74 g／L。

圖2 金露梅提取物對酪氨酸酶單酚酶穩態酶活性的影響

3.2 金露梅提取物對酪氨酸酶二酚酶活性的影響 按“2.2” 項下方法測定A475，結果見圖3。由此可知，二酚酶催化氧化L-多巴過程中無時間延遲，隨著提取物溶液質量濃度升高，曲線斜率明顯增長，表明它可在一定程度上抑制二酚酶反應；在提取物溶液質量濃度相同的反應體系中，吸光度會隨著時間延長而增大，但速率逐漸下降，表明二酚酶對氧化反應的催化速度變小。

圖3 金露梅提取物對酪氨酸酶二酚酶作用的進程曲線

金露梅提取物質量濃度存在差異時，會給酪氨酸酶催化氧化反應造成影響，改變其L-多巴的穩態酶活性（即0～6 min 的相對酶活性）。圖4 顯示，隨著提取物溶液質量濃度不斷升高，穩態酶活性降低，IC50約為4.31 g／L。

圖4 金露梅提取物對酪氨酸酶二酚酶穩態酶活性的影響

3.3 金露梅抑制酪氨酸酶二酚酶活性的機理 按“2.2”項下方法測定A475，計算初速度V0，繪制濃度-初速度曲線，結果見圖5。由此可知，隨著多巴溶液濃度升高，V0不斷增長；金露梅提取物溶液質量濃度變化對酪氨酸酶二酚酶活性有不同程度的抑制作用，而且隨著其質量濃度升高，與二酚酶的反應逐漸穩定，表明提取物會與底物競爭與酶結合，催化速率的下降是酶活性被抑制的后果，而不是因為酶喪失活性造成的。因此，可認為金露梅提取物對酪氨酸酶的作用為可逆性抑制［22］。

以底物L-多巴溶液質量濃度、V0倒數為指標，結合Lineweaver-Burk 雙倒數方程進行擬合，結果見圖6，對比酶催化反應的相應動力指數，通過表觀米氏常數（Km）、最大反應速度（Vm） 來判斷抑制類型［23］。由圖6A 可知，雙倒數圖中的1組直線在第二象限內交叉于一點，Km、Vm都隨提取物溶液質量濃度的升高而變化，Km增加，Vm值減少，表明提取物對酪氨酸酶的抑制機理為混合型效應，即它與酶在不斷作用的過程中可同時與游離酶和酶-底物的絡合物結合，從而發生非競爭性抑制反應，并且與L-多巴在相互競爭中和酪氨酸酶發生反應而形成競爭性抑制。

圖5 金露梅提取物溶液質量濃度與其抑制作用的關系

根據Lineweaver-Burk 雙倒數方程的斜率、縱截距，結合金露梅提取物溶液質量濃度來制圖，用于判斷結合度，結果見圖6B、6C。由此可知，提取物對游離酶的抑制常數（KI）為3.76 g／L，而對酶-底物絡合物的抑制常數（KIS） 為8.65 g／L，即它與游離酶的反應程度高于與酶-底物絡合物的。

圖6 金露梅提取物對酪氨酸酶催化氧化L-多巴抑制作用的Lineweaver-Burk 雙倒數方程

4 結論

金露梅50%乙醇提取物經大孔樹脂純化后，總多酚含有量為171.13 mg／g，可在一定程度上抑制酪氨酸酶活性，并對單酚酶、二酚酶均存在顯著的抑制作用，它抑制單酚酶反應遲滯時間的延長是主要表現，當后者活性降低到一半時其IC50約為3.74 g／L，而對二酚酶約為4.31 g／L。通過Lineweaver-Burk 雙倒數圖發現，提取物對二酚酶存在混合型抑制作用，對游離酶、及酶-底物絡合物的抑制常數分別為3.76、8.65 g／L，表明它具有良好的美白活性，今后可對其主要有效成分及細胞生物學方面進行深入研究。