白頭翁皂苷對B16-F10 黑色素瘤荷瘤小鼠炎癥因子的影響及機制初步研究

吳淼林 羅穎穎 嚴 新 陳蘭英 崔亞茹 劉 鵬 謝欣序 余 軍

（1.江西中醫藥大學 轉化醫學中心， 江西 南昌330004； 2.江西中醫藥大學 國家工程研究中心， 江西南昌330004； 3.江西中醫藥大學 第二附屬醫院， 江西 南昌330012）

炎癥是機體應對刺激做出的防御反應，適度的炎癥反應對機體起保護作用，而持續存在、無法消退的炎癥可誘導腫瘤的發生，在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移中起到重要作用［1］，其被稱為惡性腫瘤的第七大生物學特征［2］。大量流行病學資料表明，炎癥與腫瘤的發生發展息息相關，如幽門螺桿菌的感染使得胃癌發生的幾率上升［3］；慢性乙肝、丙肝以及肝吸蟲感染使患者患肝癌的風險增加［4］。炎性細胞的長期浸潤可介導正常上皮細胞發生惡性轉化，同時，不同的炎癥因子的分泌，可以促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，促進血管發生及腫瘤的侵襲轉移，使腫瘤成為“永不愈合的創傷”。

中醫藥在提高機體免疫力，治療腫瘤，減少副作用方面具有一定的優勢，是潛在的腫瘤治療方法。白頭翁Pulsatilla chinensis（Bunge） Regel.始載于《神農本草經》，其性寒、味苦，具有清熱解毒、燥濕殺蟲、涼血止痢的功效，還具有抗炎、抗寄生蟲、抗菌等功能［5］。白頭翁主要活性成分——白頭翁皂苷，具有提高機體免疫力、抗腫瘤等作用，其能通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖［6-7］以及擾亂腫瘤能量代謝［8］等方式抑制腫瘤的發展。但白頭翁皂苷對荷瘤小鼠相關炎癥的影響尚未見報道。本研究擬采用B16-F10 荷瘤小鼠模型，觀察白頭翁皂苷抑制腫瘤發展的作用及對包括炎癥因子在內的細胞因子（IL-6、TNF-α、IFN-γ 等） 的影響，探討白頭翁皂苷影響炎癥因子與抑制黑色素瘤的作用間的潛在機制。

1 材料

1.1 動物、細胞 SPF 級C57BL／6 小鼠43 只，雄性，4～5周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（湘） 2016-0002；黑色素瘤細胞（B16-F10） 購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 藥物與試劑 白頭翁藥材，購自河北安國，產地為遼寧綏中市，經蘇州學藥學院中藥教研室李笑然教授鑒定為毛茛科白頭翁屬植物白頭翁Pulsatilla chinensis（Bge.）Regel 干燥根。白頭翁藥材經70%乙醇回流提取3 次，1%NaOH 水溶液堿水解反應，調節pH 值，上大孔樹脂柱經不同濃度乙醇洗脫，真空干燥，得白頭翁皂苷棕褐色粉末，提取分離純化實驗由本部門馮育林教授完成，以白頭翁皂苷B3 為對照品，檢測總苷含有量達90%。胎牛血清（批號1740735，美國Gibco 公司）；DMEM（批號20170616，北京索萊寶科技有限公司）；TRIzol 試劑（批號119702，美國Invitrogen 公司）；RIPA 裂解液（批號20171027，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；BCA 蛋白定量檢測試劑盒（批號20171026，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；8%聚丙烯酰胺凝膠（批號20171026，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；PageRuler（批號00442922，美 國 Thermo Fisher 公司）；電泳液（批號20171027，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；轉膜液（批號20171027，江蘇凱基生物技術股份有限公司）；PVDF 膜（批號SE2372541B，美國Thermo Fisher 公司）；Difco Skim Milk（批號ser3106120，美 國 BD 公 司）；Albumin from bovine serum（批號B0016K021000，白鯊生物科技有限公司）；TBS（批號20171019，北京索萊寶科技有限公司）；Tween-20（批號822L0419，北京索萊寶科技有限公司）；β-actin（批號RL240559B，美國Invitrogen 公司）；p-Akt（批號28，美國Cell Signaling 公司）；Akt（批號6，美國Cell Signaling 公司）；辣根酶標記的山羊抗鼠IgG 抗體（批號133499，北京中杉金橋生物技術有限公司）；山羊抗兔IgG 抗體（批號133599，北京中杉金橋生物技術有限公司）；ECL（康為世紀生物科技有限公司）；RNase-Free Water（批號50207，康為世紀生物科技有限公司）；胰酶（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；乙醇（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；PBS（批號L50324，北京索萊寶科技有限公司）；異丙醇（分析純，西隴化工股份有限公司）；細胞因子檢測試劑盒（批號740005，美國biolegend 公司）；實時熒光定量PCR（Real-time PCR） 試劑盒（批號1802049，德國Applied Biosystems 公司）。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序 列，INF-γ 正 向5′-CCA AGCGGCTGACTGAACTC-3′，反向5′-TGGCCCGGAGTGTAGACATC-3′；IL-6 正向5′-G TGGCTAAGGACCAAGACCA-3′，反 向 5′-ACCACAGTGAGGAATGTCCA-3′；β-actin正向5′-ATGACCCAGA TCATGTTTGA-3′，反向為5′-TACGACCAGAGGCATACAG-3′。

1.3 儀器 生物安全柜［力康儀器（上海） 有限公司，HFsahe900LC］；流式細胞儀（美國貝克曼公司，Gallios）；臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，L535R）；二氧化碳培養箱（美國Thermo Scientific 公司，3111）；熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司，ABI7500）。

2 方法

2.1 細胞培養 液氮中取出B16-F10 細胞，37℃水浴迅速復溫，轉移至離心管，離心去上清，置于含10% FBS 及1%青霉素-鏈霉素的DMEM 高糖培養基中重懸，轉移至培養皿，37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。待細胞生長至鋪滿皿底90%，細胞傳代培養或用于實驗。

2.2 小鼠皮下移植瘤模型建立、動物分組及給藥 將40只C57BL／6 小鼠隨機分為模型組及白頭翁皂苷低、中、高劑量（100、200、400 mg／kg）組，共4組，每組10 只，另設正常組3 只。體外培養B16-F10 細胞，取對數生長期的細胞，用1 × PBS 調整細胞濃度至2.5 × 106／mL，0.2 mL／只，皮下接種于C57BL ／6 小鼠右前肢腋下。皮下接種黑色素瘤次日開始給小鼠灌胃給藥，1 次／d，連續13 d。

2.3 黑色素瘤生長抑制檢測 待皮下腫瘤瘤塊長到可觸程度時，使用游標卡尺分別測量腫瘤的長和寬（即最長直徑和最短直徑），1 次／d，腫瘤體積＝0.5×長×寬×寬，繪制腫瘤生長曲線。末次給藥后第2 天眼眶取血，脫臼處死荷瘤小鼠，剝離瘤體稱定質量，計算腫瘤的抑制率，腫瘤抑制率＝（1-各給藥組腫瘤質量／模型組腫瘤質量） ×100%。將腫瘤組織用錫箔紙包裹-80℃保存備用。

2.4 流式細胞術檢測細胞因子表達 正常組選取3 只動物，其余各組每組隨機選取6 只動物外周血血清，流式細胞術檢測IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、IFN-γ 等細胞因子的表達，相關操作按照試劑盒說明進行。

2.5 RT-PCR 檢測相關基因mRNA 的表達 每組隨機選取3 只動物腫瘤組織，稱取30 mg 加1 mL TRIzol 試劑，冰上勻漿2 min，加入苯酚氯仿200 μL 靜置3 min，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清450 μL，加入異丙醇450 μL，渦旋震蕩，4℃、12 000 r／min 離心10 min，棄上清，加 入 4℃、75% 乙 醇 1 mL，渦旋震蕩，4℃、7 500 r／min離心5 min，棄上清加入RNase-Free Water 20 μL混勻，Nanodrop 儀器測定RNA 濃度。使用反轉錄試劑盒逆轉錄mRNA 成cDNA，使用Real-time PCR 試劑盒檢測組織中IL-6、INF-γ、β-actin基因表達的變化。PCR 擴增條件，Holding Stage，50℃、2 min，95℃、10 mins；Cycling Stage，95℃、15 s，60℃、1 min，40 cycles；Melt Curve，95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、30 s，60℃、15 s。數據由Excel 軟件分析比較得出，使用2-△△ct表示基因相對表達量。

2.6 Western blot 檢測相關蛋白表達 -80℃冰箱取出B16-F10 腫瘤組織，每組隨機取3個樣品，各稱取30 mg 置于200 μL 含1%PMSF 和1%新配置的磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中，在冰上充分勻漿并反應30 min。用BCA 蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，加入Loadding Buffer，100℃反應5 min 使蛋白變性，分裝-80℃凍存。根據待檢測蛋白的分子量配置8%的聚丙烯酰胺凝膠，各樣品上樣30 μg 總蛋白，6 μL PageRuler，電泳90 V 恒壓集聚蛋白，120 V 恒壓分離蛋白。電泳結束后轉膜，將SDS 凝膠上充分分離的蛋白轉至PVDF 膜上，恒流200 mA、4℃、2 h。然后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。用TBST 洗膜3 次，每次5 min。修剪條帶，分別加入鼠抗β-actin（1∶1 000）、鼠抗p-Akt（1∶500）、兔抗Akt（1∶1 000） 4℃過夜。TBST 洗膜3次，每次5 min。條帶分別用辣根酶標記的山羊抗鼠IgG 抗體（1∶3 000）、山羊抗兔IgG 抗體（1∶3 000） 室溫孵育1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min。然后eECL 化學發光法顯影。使用ImageJ 軟件分析。

2.7 統計學方法 所有數據輸入GraphPad Prism 5 軟件進行處理，計量資料以（） 表示，多組數據比較采用方差分析，P≤0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 白頭翁皂苷對皮下移植瘤生長的影響 白頭翁皂苷連續灌胃給藥13 d 后，處死小鼠，剝離皮下移植瘤瘤體稱定質量，結果顯示，與模型組比較，各白頭翁皂苷給藥組腫瘤瘤重均減小（P＜0.05）。低、中、高劑量組抑瘤率分別達到30.62%、46.15%、37.65%。腫瘤生長曲線也顯示各給藥組腫瘤體積均持續顯著小于模型組，見表1、圖1。

表1 白頭翁皂苷對荷瘤小鼠腫瘤影響（， n＝10）

表1 白頭翁皂苷對荷瘤小鼠腫瘤影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 白頭翁皂苷對荷瘤小鼠血清中細胞因子的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清IL-6 水平增加（P＜0.05）；TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5 水平差異無統計學意義；與模型組相比，白頭翁皂苷低、高劑量組IL-6 水平下降，白頭翁皂苷低、中、高劑量組INF-γ 水平下降（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

圖1 白頭翁皂苷對荷瘤小鼠瘤體影響

3.3 白頭翁皂苷對腫瘤組織中炎癥因子的影響 基于白頭翁皂苷下調荷瘤小鼠血清中炎癥因子IL-6 和INF-γ 表達的結果，本研究采用RT-PCR 技術檢測了荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6 和INF-γmRNA 表達，結果顯示，與模型組相比，白頭翁皂苷高劑量組IL-6 mRNA 表達下降，白頭翁皂苷中、高劑量組INF-γmRNA 表達下降（P＜0.05，P＜0.01），與血清中INF-γ 和IL-6 的表達結果相一致，見圖3。

3.4 白頭翁皂苷對腫瘤組織中Akt 信號通路的影響 白頭翁皂苷連續灌胃13 d 后，與模型組相比，白頭翁皂苷高劑量組p-Akt 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖4。

4 討論

中藥抗腫瘤是抗腫瘤藥物研究方向之一，其副作用低的優勢也使得中藥在抗腫瘤方面有著不可替代的作用，已報道［6-8］白頭翁具有抗腫瘤的作用，但其是否能通過炎癥途徑抑制腫瘤的發生發展還不明確。炎癥在腫瘤的發生發展過程中扮演了重要角色，炎癥反應的持續存在促進了腫瘤的發生及惡性轉化。本研究從炎癥角度探討白頭翁活性成分白頭翁皂苷體內抗腫瘤的作用和機制，結果顯示白頭翁皂苷可以顯著抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生長，下調荷瘤小鼠血清中IL-6、IFN-γ 等炎癥因子及下調腫瘤組織中的IL-6、IFN-γ 水平，同時，抑制了腫瘤組織中Akt 的磷酸化。

IL-6 是一種可由多種細胞分泌的促炎因子，在多種惡性腫瘤中檢測出IL-6 高表達，其在炎癥與腫瘤聯系中發揮重要作用［9］。IL-6 除了參與維持慢性炎癥狀態和致癌微環境外，還通過誘導T 細胞等免疫細胞分化，降低免疫細胞活性，促使癌細胞能夠逃避抗癌免疫反應。腫瘤內的IL-6能激活多種信號通路抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖和存活，加速腫瘤血管新生和轉移，對腫瘤的進展起到促進作用［10］。IL-6 可誘導上皮-間質轉化，并隨后促進硬性顱咽管瘤的轉移［11］。眾多研究表明，乳腺癌［12-13］、卵巢癌［14］、胃癌［15］等多種腫瘤中高表達IL-6，且往往與患者的預后不良相關。IL-6 促腫瘤的機制可能是IL-6 分泌后與受體IL-6R 結合為IL-6／IL-6R 復合物，通過募集信號轉導亞基gp130 激活PI3K／Akt 途徑促進腫瘤細胞存活和多藥耐藥性［16-17］。本研究也表明在皮下接種B16-F10 腫瘤后，與空白組相比，模型組荷瘤小鼠血清中IL-6 水平顯著升高。經白頭翁皂苷灌胃治療后，與模型組相比，給藥組血清（低、高劑量組） 及腫瘤中（高劑量組） IL-6 水平顯著降低，表明白頭翁皂苷可以抑制黑色素瘤荷瘤小鼠血清和腫瘤中IL-6 的表達，進而抑制腫瘤進展。

圖2 白頭翁皂苷對荷瘤小鼠外周血中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、INF-γ 水平的影響（正常組n＝3，其余組n＝6）

TNF-α 是腫瘤炎癥微環境中由多種基質細胞及腫瘤細胞產生的一種炎癥細胞因子，其可以通過自分泌和旁分泌的方式，引起促炎作用及免疫調節。越來越多的研究表明TNF-α 對腫瘤的進展起到促進而非抑制的作用。炎癥微環境中的TNF-α 能夠直接促進腫瘤的形成生長和轉移，也能通過促進腫瘤血管的生成促進腫瘤的進展［18］。Shang 等［19］研究發現TNF-α 可誘導上皮-間質轉化，從而促進肺癌的轉移，進一步支持這種觀點。Yu 等［20］通過對360 例胃癌患者的研究發現TNF-α 基因的GA308 基因型是胃癌的易感基因。Zhu 等［21］研究表明膽囊癌細胞中自分泌TNF-α的減少可以對細胞在體外生長和遷移的能力產生抑制作用，沉默TNF-α 基因能降低Akt 表達和磷酸化。這些研究都指向TNF-α 起到促進腫瘤進展的作用。本研究顯示，白頭翁皂苷高劑量降低荷瘤小鼠血清中TNF-α 水平。提示白頭翁皂苷可能通過下調黑色素瘤荷瘤小鼠血清中的TNF-α 表達，從而抑制腫瘤發展。

圖3 白頭翁皂苷對荷瘤小鼠腫瘤中IL-6 和INF-γ mRNA 表達的影響（n＝3）

圖4 白頭翁皂苷對荷瘤小鼠腫瘤中p-Akt 蛋白表達的影響（n＝3）

IFN-γ 是一種由活化的T 細胞、天然殺傷（NK） 細胞等多種細胞分泌的細胞因子，其在腫瘤微環境中起多種作用。有研究認為IFN-γ 是抗腫瘤細胞因子［22］，但也有大量證據表明該分子具有促進胃癌［23］、黑色素瘤［24］、卵巢癌［25］等多種腫瘤進展的作用。體外研究發現，IFN-γ 刺激的原代口腔上皮細胞獲得了癌干細胞的一些特性，IFN-γ具有誘導上皮-間質轉化的能力，IFN-γ 信號可能與口腔扁平苔蘚的惡性轉化有關［26］。這些研究都表明IFN-γ 對腫瘤的進展起到促進作用，而這一功能可能是通過調控Akt 信號通路來實現的。IFN-γ 可通過增強CD74 的表達，激活黑素瘤中的PI3K／Akt 途徑，促進腫瘤存活［24］。本實驗也得到類似的結果，B16-F10 腫瘤細胞的浸潤使得荷瘤小鼠血清中的IFN-γ 水平增加。白頭翁皂苷給藥治療后，與模型組相比，白頭翁皂苷（低、中、高劑量組） 降低荷瘤小鼠血清IFN-γ 水平，白頭翁皂苷（中、高劑量組） 抑制荷瘤小鼠腫瘤IFN-γmRNA 表達，表明白頭翁皂苷可能通過抑制IFN-γ 表達，從而抑制腫瘤發展。

Akt 是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K 下游重要蛋白，磷酸化激活后可以通過多種途徑促進腫瘤的進展［27］。Akt 被磷酸化激活后，對炎癥的調節具有重要作用，可調控包括IL-6、TNF-α 和INF-γ［28-29］在內的多種促炎因子的表達。同時，Akt 信號通路也受包括IL-6［16］、TNF-α［21］、INF-γ［24］在內的多種炎癥因子調控，這就形成了Akt 信號通路與炎癥因子相互促進的正向循環，從而維持局部炎性微環境，促進腫瘤的發生發展。本研究顯示，白頭翁皂苷能顯著抑制Akt 的磷酸化激活，抑制腫瘤的進展。

綜上，白頭翁皂苷可通過抑制炎癥因子表達等多種途徑抑制腫瘤的發生發展，這可能是通過抑制Akt 的磷酸化，從而抑制IL-6、TNF-α、IFN-γ 等炎癥因子的表達，改善了腫瘤炎癥微環境，進而抑制腫瘤的發展，具體的機制還需進一步研究。