攜hVEGF165表達載體陽離子脂質微泡的制備

伍巧玲，丁云川，冉海濤，王志剛，陳 劍，王慶慧，張 鍵

（1.昆明醫科大學；2.昆明市延安醫院 超聲醫學科，云南 昆明 650051；3.重慶醫科大學超聲影像學研究所 重慶 400010）

目前基因治療用于臨床實驗研究越來越多，而輸送基因入體內的方法較多，但都存在一定的缺陷，如在輸送途中基因被降解，基因不穩定，輸送載體可能會引起免疫反應等。將超聲造影技術與基因治療結合起來，能顯著提升基因的轉染效率[1]，充分發揮治療疾病的作用。超聲造影劑可作為一種安全有效的基因載體，靶向精準治療，延長了造影劑在病區滯留時間，特異性增強了顯影效果，在診斷疾病的同時，又能擊破造影劑精準釋放基因，促使基因進入細胞內轉染，有著廣闊的臨床應用前景。

陽離子脂質微泡造影劑通過電荷孵育法與帶負電荷的基因相連輸入體內，實時觀察造影劑的顯影途徑，使用低強度聚焦超聲技術靶向輻照擊破微泡，釋放基因，并促使其轉染，較高的提高了基因轉染效率[2-4]。

資料與方法

一、藥品和試劑 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、氨基甲酰基膽固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，全氟丙烷氣體，PBS緩沖液，甘油。

二、儀器 Malvern激光粒徑、電位測量儀；銀汞膠囊調合器；投射式電子顯微鏡；光學顯微鏡、倒置熒光顯微鏡；紫外線分光光度計；電子天平；微量加樣槍；血球計數板。

三、實驗方法 1.陽離子脂質微泡的制備：將一定比例的二棕櫚酰磷脂酰膽堿、氨基甲酰基膽固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇2000、甘油、PBS、三氯甲烷、全氟丙烷等經旋轉蒸發、機械振蕩，制備出陽離子脂質微泡。

2.測定陽離子脂質微泡的理化特性：光鏡和電鏡下分別觀察微泡形態、濃度及分布；使用血球計數板測定其濃度；使用Malvern激光粒徑、電位測量儀測定其粒徑大小、Zeta電位。

3.測定陽離子脂質微泡與hVEGF165表達載體的結合率：將一定同濃度的微泡與不同量的hVEGF165表達載體通過電荷孵育法結合，待微泡出現分層后，上層為微泡與基因結合層，下層為未與微泡結合的游離基因液體，取下層清亮液體，用紫外線分光光度計測量游離的基因濃度，將基因總量減去剩余游離的基因量，除以基因總量，所得微泡結合基因的結合率。

分別將微泡使用Dio 染色成綠色熒光，hVEGF165表達載體使用Gel染色成紅色熒光。使用電荷孵育法，將微泡與hVEGF165表達載體結合，在倒置熒光顯微鏡下觀察兩者的結合情況。

結果

一、制備的陽離子脂質微泡 肉眼觀察：微泡呈現乳白色的混懸液，見圖1。400倍光學顯微鏡觀察：微泡呈圓球形，大小形態相對均一，分散情況良好，無明顯聚集現象，見圖2。透射電子顯微鏡放大不同倍數觀察：較清晰顯示外層包裹的磷脂材料薄膜以及內部的全氟丙烷，表面尚光滑，見圖3。

二、微泡粒徑、電荷及濃度 微泡制備后1h，1d，7d，2W和4W，分別用馬爾文納米粒度Zeta 分析儀檢測平均粒徑和表面電位，用血球計數板計數濃度，見表1，圖4、5。

三、微泡與基因結合率 將染色后的微泡與質粒連接后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，綠色激發光激發后，可見微泡呈現綠色熒光，紅色激發光激發后，在微泡表面呈紅色熒光包繞，表明染有紅色熒光的質粒與染有綠色熒光的微泡連接成功，見圖6、7。

四、紫外線分光光度計檢測結果 將不同基因量與一定的同濃度微泡通過電荷孵育法連接，微泡隨著基因量的增加，基因連接率增加，在基因為40μg 時，結合率為（35.34±0.71）%，結合率達到最高，之后隨著基因量的增加，結合率出現降低，見表2。

討論

脂質體曾經一直是攜帶基因治療載體的研究熱點，由于脂質體的成分與細胞的脂質成分相同，所以有較高的生物相容性，利于細胞的內吞，所攜帶的基因容易進入細胞內轉染。基因帶負電荷，則陽離子脂質體基因載體隨之被研究，其表面所攜帶的正電荷與帶負電荷的基因，通過電荷孵育法而吸附到一起，從而有一定的攜帶基因能力[5,6]。陽離子脂質微泡造影劑是脂質體的一種特殊類型，聯合超聲造影劑的優點，在超聲技術條件下，觀察造影劑的顯影途徑，造影劑聚集在靶器官區域時，使用低強度聚焦超聲技術靶向輻照擊破陽離子微泡，釋放基因，利用超聲波輻照所產生的空化效應及聲孔效應，使得基因進入細胞內或細胞核而發生轉染，較高的提高了基因轉染效率[4]。

本實驗使用機械振蕩法制備出以陽離子膽固醇為核心的陽離子脂質微泡，平均粒徑：（1.31±0.23）μm，表面電荷：（28.00±1.84）mV，濃度：（3.17±0.16）×108，微泡的粒徑大小合適，濃度及Zeta電位相對較穩定。電子顯微鏡投射及光鏡下觀察兩種脂質微泡形態穩定，大小均一，分布均勻。使用電荷孵育法與攜帶表達hVEGF165的質粒相結合，通過倒置熒光顯微鏡觀察微泡與基因結合情況，使用紫外線分光光度計計算基因與微泡的結合率。倒置熒光顯微鏡從定性角度檢測微泡是否與基因連接成功，而紫外線分光光度計從定量角度測量的微泡基因攜帶率，陽離子脂質微泡最大結合率約（35.34±0.71）%，與普通脂質微泡相比，陽離子微泡具有較高的攜帶基因的能力，以上結果與之前文獻報道相似[7,8]。張清鳳等[9]使用脂質材料通過薄膜水化法，制作出了陽離子脂質微泡，最高的載基因率為39.7%。傳統普通脂質微泡攜帶基因量低，轉染率不高，但由于基因轉染過程中無毒和無毒副作用，聯合超聲技術，可實現靶向區域轉染基因的特點，曾受到廣大學著的關注，提高其基因攜帶能力也一直是研究熱點。隨著陽離子脂質微泡的產生，普通脂質微泡攜帶基因能力低的問題得到了解決，多篇文獻報道，陽離子脂質微泡造影劑攜帶基因的轉染率有了大幅度的提高，是普通微泡造影劑的20倍[10]，陽離子脂質微泡造影劑攜帶基因體內轉染有較突出的優勢。

表1 微泡平均粒徑、表面電荷及平均濃度（±s）

表1 微泡平均粒徑、表面電荷及平均濃度（±s）

注：h為小時，d為天，W為周，不同時間檢測各值間的比較。

組別濃度（108 個/mL）7d 3.03±0.15 Zeta 電位（mV）28.00±1.84 25.20±1.71 18.38±0.76平均粒徑（μm）1.31±0.23 1.47±0.58 1.45±0.21 1h 3.17±0.16 1d 3.06±0.17 2W 2.94±0.16 13.86±1.27 1.55±0.20 4W 1.76±0.20 9.68±0.56 1.68±0.19

表2 微泡與不同基因濃度時基因結合率%比較（±s）

表2 微泡與不同基因濃度時基因結合率%比較（±s）

注：微泡制作后，2h內完成測量各數據。

基因量（μ）20 40 60結合率（%）17.12±.30 35.34±.71 28.42±1.07 80 29.00±1.70

圖1 微泡實物圖

圖2 微泡光鏡圖

圖3 微泡電鏡圖

圖4 微泡平均粒徑

圖5 表面電位

圖6 綠色熒光示微泡

圖7 紅色熒光示質粒附著微泡

本實驗存在不足之處，所制備出的微泡未能制作成干粉狀態，只能以液體形式存在，長期保存可能會影響微泡粒徑大小、濃度及Zeta電位。另外所制備的攜hVEGF165表達載體陽離子脂質微泡未能進行動物實驗，其轉染率需進一步驗證。