比色法快速評估飼料中的水溶蛋白及其應用

李 亮 樊福好

（廣東省畜牧技術推廣總站，廣東廣州 528300）

飼料中的蛋白質含量是評價飼料營養的重要指標，測定蛋白質的方法有凱氏定氮法（國際經典測定方法）、分光光度法、滴定法等。飼料行業中測定蛋白質最常用的方法是凱氏定氮法，它是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一，被普遍作為檢驗蛋白質的標準方法。但凱氏定氮法無法區分“真蛋白”與其他含氮有機物，在生物蛋白的檢測中有一定的局限性，因此，Folin—酚試劑法、Lowry法、考馬斯亮藍法等許多其他的蛋白檢測方法也得到了大量研究和發展[1]。

飼料中的有機氮并不能完全被動物利用，僅測定總有機氮無法完全反映飼料的營養價值，所以測定水溶性蛋白的檢測方法得到了發展和應用[2]?？捡R斯亮藍法是目前實驗室中最常見、靈敏度最高的一種測定水溶性蛋白質含量的方法[3]。它將比色法和染料結合法相結合，與Lowry法等其他方法相比，具有所需樣品量少、測定速度快、操作簡便等優點[4]，適合于大批量、低可溶蛋白樣品的測定[5]，被廣泛應用于各類生物樣品的水溶性蛋白含量測定[6]。該方法還具有干擾物質少的特點，是生物化學、植物生理學等實驗課程中的經典實驗項目之一。

水溶性蛋白也是評價動物飼料蛋白營養的重要指標之一，尤其是大豆中只有可溶蛋白才能被利用[7]，但一般植物體內水溶性蛋白含量較低[8]，目前對飼料中水溶性蛋白的研究較少[9]，也沒有與生長性能關系研究的報道，但也有研究發現，在探索豬的健康快速評價方法時，可應用顯色法對飼料蛋白營養進行快速判定[10]。為簡化試驗方法并推廣其在生產中的應用，樊福好參考比色法定義了一個命名為“朊度”的無量綱，即利用微型電子裝置發明了便攜型檢測設備，可發出特定波長的光線，并利用電子感應裝置測量溶液透光特性，根據透光特性的變化，在顯示屏上顯示0～100的數值，規定為“朊度”值。為了評估快速檢測技術在生產一線的應用價值，本研究將“朊度”值與721G分光光度計測量值進行了比較和相關性分析，并對小豬飼料的基本營養價值和“朊度”值進行了測量，與部分生長性能指標進行了聯合分析，希望為動物飼料的快速、簡易評價方法的開發提供參考，增加終端用戶對動物飼料的快速評估手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

配制1 mg/mL牛血清蛋白（BSA,Bovine Serum Albumin）溶液，并按 0.125 mg/mL的梯度稀釋至0.125 mg/mL；顯色試劑和便攜型光學檢測設備由廣州九卦生物科技有限公司提供；721G可見分光光度計由上海精科實業有限公司生產；購買4種市售小豬飼料：甲公司中、低檔料分別編號為1、2號，乙公司中檔料編號為3號，丙公司中檔料編號為4號；隨機采樣檢測其營養成分（見表1）。動物試驗選用50～70日齡三元雜閹公豬66頭，隨機分成A、B、C、D 4個組，其中A組16頭，B組16頭，C組17頭，D組17頭。

表1 各飼料主要營養價值分析

1.2 試驗方法

取不同濃度的BSA溶液1份加入9份顯色試劑中進行顯色反應，10 min后分別使用721G分光光度計和便攜型光學檢測設備測量溶液的吸光度和“朊度”值，并分析其相關性和相對標準誤差。取5 g飼料置燒杯中，加45 mL水浸泡20 min后用玻璃棒攪拌，之后靜置3 min，取上清液1份加入9份顯色試劑，反應10 min，使用便攜型光學檢測設備測量其“朊度”值。動物試驗在廣東某規模豬場進行，各組飼養條件一致，密度適中，自由采食飲水，常規飼養管理。試驗開始與結束時早晨空腹稱重。記錄試驗期間豬的采食量，計算平均采食量、平均增重、平均末重、料肉比等。

1.3 分析方法

根據測量值計算平均值、相對標準偏差（RSD，Relative Standard Deviation）并進行比較；選擇SPSS數據分析軟件的單因素ANOVA或非參數檢驗進行數據分析，并進行S-N-K或Tamhane's T2事后多重比較，結果以“平均數±標準差”表示。使用Pearson進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 吸光值測量結果與分析

測量不同濃度BSA溶液吸光值，同步測量“朊度”值，并進行相關度分析。不同濃度BSA溶液在592 nm的吸光度與對應“朊度”值見表2。分析“朊度”測量值與不同濃度BSA在592 nm的吸光度相關性見表3。通過對每次測量重復10次，并計算其標準偏差（STDEV,StandardDeviation）和相對標準偏差可得表4。

表2 不同濃度BSA溶液在592 nm吸光度和 “朊度”測量平均值

表3 “朊度”與BSA溶液在592 nm吸光度的相關系數

表4 不同濃度BSA溶液10次 “朊度”測量值重復性特征

利用表2的數據，以OD592為X值，對“朊度”（Y） 求回歸方程，可得 Y＝80.919X－18.225，2＝0.988，可知回歸直線對觀測值的擬合程度較好；通過分析二者的相關性（見表3），可知“朊度”測量值與BSA溶液在592 nm處的吸光度有極顯著正相關（＜0.01）；通過計算其標準偏差和相對標準偏差可知（見表4），其RSD均小于5%，可以認為儀器測量結果比較穩定可靠。

在實際生產中，飼料企業要測量自有產品的蛋白質含量，一般采用凱氏定氮法，需要花費大量的人力物力和時間；即便近年許多飼料企業采取了近紅外光譜法（NIR,Near Infrared）快速測量飼料營養，但由于各地原料、配比各不相同，各企業也要在建立模型、數據庫的修正和維護上花費大量的人力物力，上述因素都導致了飼料檢測成本較高。此外，工廠的測量數據一般是企業的商業秘密，所取得的數據一般也只是用于生產質控，而不適宜用于營銷，更遑論向客戶公開。

因此，在養殖生產一線的決策者對飼料蛋白營養價值的了解和判斷，都僅限于飼料標簽上模糊的范圍和業務員口頭的承諾，最多也只是采一點樣送到機構檢測化學成分。對于送檢也存在以下3方面問題：①時間差，外檢最快也要1個星期出結果，影響決策的及時性；②對于飼料營養價值的實際生物利用價值沒有有效判斷，如三聚氰胺就是典型的例子；③送檢的樣品往往還有采樣規范性、采樣數量、檢測成本等多方面的限制，導致檢驗結果實際應用價值有限，不僅指導生產的作用有限，而且連打官司都不好作為有力證據。因此，對于生產一線的決策者和飼料業務員而言，更需要一種快速、可靠的判斷飼料相對營養價值的工具，而“朊度”檢測在一定程度上，可以承擔這樣的任務。

“朊度”檢測只需要一點飼料，即可用近乎“零”的成本，在短短20 min內得出一個相對可靠的結論。與傳統的在杯子里泡一點飼料，然后觀看飼料成分上浮、下沉不同的是：“朊度”測試可以給出一個具體的數字，而且這個數字不僅穩定可靠（RSD＜5%，見表4），還與規范操作的蛋白成分檢測數據呈極顯著正相關（＜0.01，見表3）。理論上，在生產一線可以利用“朊度”試劑與便攜式儀器，對飼料蛋白營養價值快速作出大量可靠的相對性測量，從而為生產決策提供快速可靠的依據。

2.2 飼養試驗結果與分析

小豬按組飼喂不同小豬料，A、B、C、D組分別飼喂1、2、3、4號料，飼養時間103 d，結果如表5。計算飼料的“朊度”測量值與生長指標相關性可得表6。

但值得注意的是：因商品飼料的原料來源廣泛、配比十分復雜，在某個試驗得出的對比結論，可能僅僅只能說明特定時空某幾種指定產品的性能差異，并不一定能代表普遍規律。本試驗中，因為“朊度”測量值剛好與飼料粗蛋白含量呈現正相關規律，而且受種種因素影響，用于對比的商品飼料所用原料可能比較接近，因此，有時“朊度”值與小豬生長成績的相關規律也可以解釋為粗蛋白含量不同所形成的影響。但不可否認的是，終端用戶在短時間內不可能知道商品飼料的實際粗蛋白值含量，在現場進行的“朊度”值測量，可以顯著提高用戶對飼料質量的快速判斷能力。

表5 試驗小豬生長數據及飼料 “朊度”測量值均值

表6 “朊度”測量值與生長指標相關性

此外，由于凱氏定氮法檢測的是樣品中所有有機氮，如果飼料中含有較多角蛋白或其他難溶有機含氮物質時，其“朊度”測量值會相對較低，這也可以在一定程度上反映不同商品飼料中粗蛋白的易消化性差異。

3 結論

參照比色法發明的便攜式檢測設備所測量的“朊度”值，與721G分光光度計測量值具有極顯著線性相關，回歸曲線的擬合度較高。分析顯示其能夠快速且穩定測量一定濃度的飼料可溶性蛋白含量。原料接近的商品飼料飼喂試驗證明，使用“朊度”值較高的飼料喂養的小豬生長成績更好，可以取得更高的經濟收益。