高溫處理對糞便大腸桿菌滅殺效果的研究

李含雄 孫 將 袁月祥

（中國科學院成都生物研究所，四川成都 610041）

目前，我國動物糞便年排泄量達38億噸[1]。大腸桿菌在畜禽糞便中普遍存在，在人畜共患病中是最常見的一種條件致病菌[2]，特別容易引起養殖動物發病[3]。殺滅包含大腸桿菌在內的病菌蟲卵，在畜禽糞便無害化與資源化中具有重要意義。常用殺滅大腸桿菌的方法包括高溫堆肥[4]、滾筒干燥[5]、厭氧消化[6]等，因大多數種類的大腸桿菌不耐熱[7]，高溫堆肥是最常用的殺滅病菌蟲卵的方法，但其滅殺效果受曝氣量、物料C/N、堆體pH值、含水率等堆肥工藝影響。近10余年來，養殖場的養殖方式和堆肥工藝發生了較大變化，但系統性研究高溫對畜禽糞便大腸桿菌滅殺作用的報道仍較少。本文系統性地研究了在不同溫度下不同處理時間對大腸桿菌的滅殺作用，并在強制好氧堆肥中進行工程驗證，闡明高溫對大腸桿菌的滅殺規律，進而指導養殖業糞便處理，達到糞便無害化標準[8]。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養基

結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養基。

1.1.2 樣品采集

新鮮雞糞取自四川省井研縣王村鎮養雞場，雞糞堆肥樣品取自該養雞場的強制好氧堆肥槽中（該堆肥槽長80 m、寬12 m、高2 m）第1、2、3、5、8、12、16、20、24 d的堆體中，取樣時，在該天槽體斷面中左、中、右三個點處取樣，取樣深度距離堆肥表面1 m，取樣后冷藏保存。

新鮮豬糞取自樂山沙灣養豬場，豬糞堆肥取自該養豬場的強制好氧堆肥槽中（該堆肥槽長30 m、寬10 m、高2 m）。取樣時間點和取樣深度同雞糞堆肥樣品。

1.2 槽式堆肥溫度測定

在堆肥樣品取樣點利用長桿水銀溫度計測定堆體溫度，同一地點測定離表面30 cm（表層）和100 cm（中層）2個深度的溫度。

1.3 高溫處理對大腸桿菌的滅殺試驗設計

稱取適量新鮮糞便樣品充分混勻，然后采用四分法取樣裝入500 mL廣口瓶中，每瓶裝100 g樣品，分別放入不同培養箱中進行高溫處理，溫度設置45℃（豬糞無此溫度）、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃等6個梯度。每隔12 h將廣口瓶中糞便混勻后取適量樣品進行大腸桿菌計數。每個試驗設3個重復。

1.4 大腸桿菌計數

均勻稱取10 g樣品，裝入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，搖床振動20 min，使得大腸桿菌均勻分布于無菌水中，將菌懸液進行10倍梯度稀釋，選取適宜梯度按照“食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數[9]”的平板計數法進行大腸桿菌計數。

2 試驗結果與分析

2.1 高溫處理對雞糞中大腸桿菌的殺滅作用

不同溫度處理不同時間后，雞糞樣品中大腸桿菌的數量結果見表1。經過不同的高溫處理，雞糞中的大腸桿菌數量均從2.0×107cfu/g下降到0 cfu/g；55℃及其以上溫度處理12 h后可全部殺滅雞糞中的大腸桿菌，45℃處理則需要72 h才能全部殺滅雞糞中的大腸桿菌。說明高溫處理可全部滅殺雞糞中的大腸桿菌，且溫度越高所需時間越短。

2.2 高溫處理對豬糞中大腸桿菌的殺滅作用

不同溫度處理不同時間后，豬糞樣品中大腸桿菌的數量結果見表2。從表2可知：經過不同的高溫處理，豬糞中的大腸桿菌數量均從1.38×107cfu/g下降到0 cfu/g；55℃及其以上溫度處理12 h后可全部殺滅豬糞中的大腸桿菌，50℃處理則需要36 h才能全部殺滅豬糞中的大腸桿菌。55℃及其以上溫度對豬糞和雞糞樣品中大腸桿菌的滅殺效果一樣，均是12 h能全部滅殺。但在稍低溫度50℃時，對豬糞樣品中大腸桿菌的滅殺效果稍弱，處理12 h時，豬糞中殘留大腸桿菌比雞糞樣品多一個數量級，全部滅殺時間比雞糞樣品要長12 h。

2.3 雞糞好氧堆肥工程中大腸桿菌變化規律

在實驗室進行高溫處理滅殺大腸桿菌試驗的基礎上，為了研究實際的高溫堆肥工程對大腸桿菌的殺滅作用，采集雞糞好氧槽式堆肥不同發酵天數的樣品來測定大腸桿菌數量，并現場測定該點溫度。其結果如圖1所示。由圖1可知，該槽式堆肥溫度從第0 d的14.5℃逐步上升，第1 d達到38℃并維持2 d中溫發酵，第5 d達到65℃（中層）～69℃（表層），一直到第16 d均維持在63℃（中層）～58℃（表層）以上，16 d以后溫度才逐步下降；且從第5 d開始，堆肥表層溫度均明顯高于中部溫度。

表1 不同高溫處理后雞糞大腸桿菌數量變化 （cfu/g）

表2 不同高溫處理后豬糞大腸桿菌數量變化 （cfu/g）

該堆肥場在進料時鋪一層雞糞后加一層輔料和適量的發酵菌種，然后用鏟車推高到2 m左右，1 d的原料全部進完后再用翻堆機從尾端開始向后翻耙，使發酵料與新鮮原輔料混勻。本試驗中，由于開始物料未充分混勻，且前面3 d物料堆肥地面未鋪設曝氣管，氧氣供應不足，故溫度第1 d升到38℃后一直維持到40℃附近；從第4 d開始曝氣后，堆體才進入快速升溫階段，第5 d至第16 d均維持在高溫階段，此為快速發酵階段。16 d后，堆體溫度逐步下降到40℃附近，說明堆肥物料中的易利用物質大量消耗，發酵產生的熱能不足以維持翻堆、水汽帶走的熱量。從第5 d開始，表層溫度高于中部溫度，估計是堆肥底部曝氣不足，導致中部沒有足夠的氧氣供發酵菌種利用，而表層疏松度較好，能從空氣中補充氧氣，從而滿足發酵菌種的氧氣需求。因此試驗采樣深度為1.0 m更具代表性。

在此過程中，堆肥中大腸桿菌數量呈指數下降，從第0 d的5.5×107cfu/g快速下降到第3 d的13.7 cfu/g，從第5 d開始堆肥中大腸桿菌的數量一直保持為0。本工程前3 d大腸桿菌的數量快速下降6個數量級，與實驗室45℃連續處理72 h可全部滅殺大腸桿菌結果相近。加上隨后連續10余天的高溫階段堆體中均沒有大腸桿菌，說明正常運行的強制曝氣槽式堆肥足以殺滅雞糞中的病菌蟲卵，滿足國標的衛生要求[8]。

2.4 豬糞好氧堆肥工程中大腸桿菌變化規律

豬糞好氧堆肥工程中不同發酵天數堆體中大腸桿菌數量和堆體溫度如圖2所示。由圖2可知，前2 d堆體溫度從室溫逐步上升到40℃，然后又下降到30℃；前5d中層平均溫度為35.4℃，表層平均溫度為29.9℃；直到第8 d才達到高溫階段，隨后溫度有所回落，并一直維持在中（中層）高（表層）溫附近。咨詢該堆肥場，得知采樣前幾天，堆體運行不太正常，影響了前5 d的升溫。加上鼓風機設備異常，堆體中后段曝氣不足，導致中部溫度明顯偏低。工程發酵異常，導致前期堆體中大腸桿菌數量明顯偏高。大腸桿菌數量從第0 d的6.2×107cfu/g下降到了第2 d的2.55×104cfu/g，隨后到第5 d仍有達到3.85×102cfu/g，第8 d進一步下降到10 cfu/g，第12 d起均下降到0 cfu/g。結合實驗室高溫殺滅大腸桿菌試驗和雞糞堆肥工程數據可知，當堆肥溫度低于40℃時，對大腸桿菌的殺滅作用就很弱。

對比2個好氧槽式堆肥工程，均有一樣的翻堆設備，但曝氣機運行工況有差異，從而導致2個工程中的堆體溫度和大腸桿菌含量均有非常顯著的差異。說明在槽式堆肥中，最重要的關鍵條件是氧氣的有效通入，翻堆只能短暫地促進空氣交換，翻堆更重要的目的是使物料更均一，曝氣才能實現更長、更持續的氧氣通入，曝氣量對畜禽糞便的無害化有著很大的影響。相比20年前Hima-thongkham等[10]以牛糞高溫堆肥大腸桿菌與沙門氏菌第10 d依然還有10%，強制曝氣好氧堆肥技術更易實現畜禽糞便的無害化。

3 結論

本次試驗研究了不同溫度滅殺新鮮畜禽糞便中大腸桿菌的效果，并對大規模的堆肥工程中的大腸桿菌與發酵溫度的變化規律進行了研究。結果表明，在45℃下持續處理72 h可有效滅殺畜禽糞便中的大腸桿菌，在堆肥工程中，由于物料均勻度和發酵溫度的差異，全部滅殺畜禽糞便大腸桿菌的時間延長到5 d。當發酵溫度低于40℃時，對大腸桿菌的殺滅作用很弱。因此需保證堆體中各點的溫度均應至少達到40℃以上。強制曝氣堆肥工程中，曝氣量是比翻堆更重要的關鍵因素，也是滅殺大腸桿菌等病菌蟲卵的關鍵參數。一個正常運行的好氧堆肥工程能夠全部滅殺大腸桿菌。