小花清風藤及其同屬藥用植物近紅外光譜鑒定研究△

孫慶文，溫迪，郭文凱，王波，徐文芬

貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025

小花清風藤SabiaparvifloraWall.ex Roxb.為清風藤科清風藤屬植物，國內主要分布于貴州西部及西南部、云南東南部至西南部、廣西西部及西南部、四川等地。除此，印度、緬甸、尼泊爾、菲律賓、泰國、越南、印度尼西亞也有分布[1]。黔西南的苗族、布依族等少數民族常用小花清風藤的莖藤治療肝炎、風濕痹痛、跌打損傷等疾病[2]?，F代研究表明，小花清風藤及同屬多種植物主要含有黃酮類、生物堿類及三萜類成分，具有明顯抗乙肝病毒、保肝、降酶、抗炎等作用[3-8]。十余年來，筆者在國家自然科學基金、貴州省一流學科建設等多個項目的支撐下，對清風藤屬藥用植物的資源、鑒定、栽培、質量以及化學藥理等方面進行了系統研究[9-13]。在長期的研究過程中，筆者發現小花清風藤與同屬(清風藤屬)的簇花清風藤S.fasciculataLecomte ex L.Chen、尖葉清風藤S.swinhoeiHemsl. ex Forb. et Hemsl.等物種在植物形態上極為相似，在沒有花、果的情況下不易準確鑒別，容易導致藥農在采集小花清風藤藥材時出現混雜，從而影響臨床療效，甚至埋下安全隱患。因此，探索準確、快速、簡便的鑒別方法，無疑是小花清風藤及其同屬植物綜合開發利用和藥材質量控制的重要課題。

近紅外光譜(NIRS)技術具有操作簡便、精密度高、無毒無損、分析時間短等特點[14]。將該技術應用于中藥材鑒別、中藥生產檢驗、藥用植物品種鑒定等方面已取得良好效果。朱斌等[15]采用近紅外光譜結合聚類分析法對20種金絲桃屬植物進行近紅外漫反射光譜法鑒別；劉沭華等[16]采用紅外光譜法結合近鄰法和多類支持向量機等模式識別技術，對白芷、丹參藥材的產地進行鑒別研究，均取得了良好的鑒別效果；孫榮梅等[17]采用近紅外漫反射光譜結合移動窗口偏最小二乘法(Moving-window Partial Least Square，mwPLS)波段選擇進行主成分分析，建立了一種對菟絲子及其同屬混淆藥材的可靠鑒別方法。近年來，NIRS技術得到了飛速發展，已被廣泛應用于農業、食品、石化和藥物分析等領域。鑒于該技術的突出優勢，筆者對7種清風藤屬植物共20批60份樣品的NIRS特征進行分析研究，以期建立小花清風藤及其同屬藥用植物的NIRS鑒別方法，為該類藥材的鑒定和質量控制提供參考。

1 材料

樣品為清風藤科清風藤屬植物的干燥葉、1年生莖、老莖(多年生)，共7個種60批樣品(小花清風藤屬葉、1年生莖、老莖各20份)，樣品均由貴州中醫藥大學藥學院的孫慶文教授鑒定為正品，憑證標本存放于貴州中醫藥大學生藥重點實驗室。材料信息見表1。

Thermo Antaris Ⅱ型傅里葉變換近紅外光譜儀(美國賽默飛公司)；InGaAs檢測器以及石英杯、100目標準檢驗篩、QE-200高速萬能粉碎機(浙江屹立工貿有限公司)。數據分析軟件：Result光譜采集軟件、TQ Analyst 8.0 化學計量軟件、SPSS 22.0軟件。

表1 供試藥材來源信息

2 方法

2.1 樣品的處理

取低溫干燥的樣品，粉碎，過六號篩(100目篩)，樣品質量>15.0 g，密封，放入干燥器中備用。

2.2 光譜數據采集

取樣品約10.0 g，置于采樣杯中，在儀器預熱30 min后，使用Result軟件，漫反射模塊采集NIRS譜圖。采集條件：掃描樣品時間30 s，掃描范圍10 000～4000 cm-1，分辨率為8 cm-1，樣品掃描3次。

2.3 數據處理

由于清風藤屬植物所含化學成分較復雜，而且NIRS譜圖自身有重疊現象，以致于難以從原始譜圖找到種間和種內的差異。通過對所有樣品的譜圖進行9點平滑并對其用二階導數、標準正態變換和多元散射校證等方法處理，消除基線漂移和噪聲干擾，應用TQ Anlyst 8.0化學計量學軟件分別對小花清風藤葉、1年生莖、老莖的NIRS數據進行相似度計算，將相似度值導入SPSS 22.0軟件中選擇歐式距離法進行系統聚類分析。分別繪制3個藥用部位的系統聚類分析圖。

3 結果與分析

3.1 NIRS特征分析

原始譜圖結果(見圖1～3)，從圖中發現只有葉的NIRS原始譜圖在波數4 139.50～7 381.78 cm-1區域部分樣品差異較為明顯，1年生莖和老莖NIRS原始譜圖的峰形、峰高都非常相似，無明顯差異。經二階導數處理后，不僅漂移和噪音得到消除，還能夠更清晰地反映樣品的特征信息(見圖4～6)。在波數4 139.50～7 381.78 cm-1的差異性較原圖更為明顯，有利于物種的區分。

圖1 20批清風藤屬植物葉NIRS原始譜圖

圖2 20批清風藤屬植物1年生莖NIRS原始譜圖

圖3 20批清風藤屬植物老莖NIRS原始譜圖

圖4 20批清風藤屬植物葉NIRS二階導數譜圖

圖5 20批清風藤屬植物1年生莖NIRS二階導數譜圖

圖6 20批清風藤屬植物老莖NIRS二階導數譜圖

3.2 NIRS相似度計算結果與分析

將60批樣品的光譜數據分別導入TQ anlyst 8.0化學計算軟件，采用相關系數分析法分別計算葉、1年生莖、老莖各樣品NIRS之間的相似度，所得結果見表2～4。

通過SPSS 22.0軟件分別對小花清風藤不同藥用部位的種內和種間NIRS相似度數值進行種內的單因素方差分析和種間的多重比較，發現葉的NIRS相似度值種間差異更顯著。對小花清風藤葉種內的NIRS相似度進行單因素方差檢驗，發現種內的NIRS相似度的數值差異無統計學意義(P>0.05)，說明小花清風藤葉片的種內化學成分比較穩定。對小花清風藤1年生莖和老莖種內的NIRS相似度進行單因素方差檢驗，發現種內的NIRS相似度的數值差異無統計學意義(P>0.05)，但與同屬其他物種比較時差異有統計學意義(見表5～8)。在對小花清風藤與其他同屬植物的種間NIRS相似度進行多重比較發現差異有統計學意義(P<0.05)，說明小花清風藤與同屬的其他物種間的化學成分差異有統計學意義，有利于對物種進行分類和鑒別(見表9～11)。

表2 小花清風藤及其同屬植物葉片近紅外光譜相似度計算結果 %

表3 小花清風藤及其同屬植物1年生莖近紅外光譜相似度計算結果 %

表4 小花清風藤及其同屬植物老莖近紅外光譜相似度計算結果 %

表5 小花清風藤葉種內NIRS相似度單因素方差檢驗

表6 小花清風藤1年生莖種內NIRS相似度單因素方差檢驗

表7 小花清風藤老莖種內NIRS相似度單因素方差檢驗

從3個藥用部位的NIRS相似度結果方差分析來看，葉片NIRS相似度比其他2個藥用部位的種內差異更小，種間差異更大。在種內比較時，小花清風藤葉、1年生莖和老莖的NIRS相似度分別為91.78%、83.41%和91.85%。在種間比較中，小花清風藤葉與同屬其他物種的種間NIRS平均相似度只有61.73%，相似度值差距明顯，說明小花清風藤與其他同屬植物葉的化學成分差異較大，有利于對其進行鑒別。1年生莖和老莖的NIRS相似度比較中，小花清風藤與同屬其他物種的1年生莖和老莖的NIRS相似度分別達到了79.39%和86.86%，NIRS相似度值相差不大，說明該屬植物莖中的化學成分較為相近。以上結果可以看出，葉片的NIRS相似度值差異較大，這對小花清風藤藥材鑒定具較大的參考價值。

表8 小花清風藤葉種間相似度多重比較(n=60)

注：P<0.05差異有統計學意義。

表9 小花清風藤葉種內和種間NIRS相似度均值

注：—表示種內樣品未比較，下同。

表10 小花清風藤1年生莖種內和種間NIRS相似度均值

表11 小花清風藤老莖種內和種間NIRS相似度均值

3.3 NIRS聚類分析

分別選擇小花清風藤及其同屬植物3個藥用部位4 139.50～7 381.78 cm-1NIRS數據，導入SPSS 22.0軟件，以歐式距離對樣品進行系統聚類分析，構建3個藥用部位的系統聚類樹狀圖，并結合NIRS相似度的結果和植物的形態學進行分析，從葉片的聚類樹狀圖中可見，當歐式距離為10時，可將小花清風藤及其同屬植物葉聚類分為四大類，A類包括6個樣，B類包括5個樣，C類包括3個樣，D類包括6個樣(見圖7～9)。A類：小花清風藤和簇花清風藤聚在一起，但在歐式距離為5時又分為2類，5份小花清風藤能夠聚在一起；B類：尖葉清風藤5個樣完全聚在一起；C類：屬于1個小類，只有平伐清風藤2個樣品和云南清風藤1個樣品聚為一類；D類：分為了2個小支，3份四川清風藤樣品聚在一起，3份鄂西清風藤樣品聚在一起。

圖8 小花清風藤及其同屬植物1年生莖NIRS聚類分析圖

圖9 小花清風藤及其同屬植物老莖NIRS聚類分析圖

綜合上述結果分析，通過對小花清風藤及其同屬植物葉的NIRS的聚類分析，小花清風藤、尖葉清風藤、四川清風藤、鄂西清風藤都能較好的區分開，可以對該屬植物達到分類鑒定的目的；然而，對1年生莖和老莖進行聚類分析，結果顯示物種間的聚類相對比較混亂，而且兩部分聚類不能得出一致的聚類結果，聚類結果與植物種類、采集時間和地點沒有形成一定的規律，從NIRS相似度來看，未能得到相吻合的結果?？赡苁且驗橹参锴o的生長年限不同，積累的化學成分也會有所差異。而在采樣過程中植物莖的生長年限不易準確判斷，故通過莖的NIRS相似度和聚類分析，無法起到較好的分類鑒別作用。

4 小結與討論

本研究選取小花清風藤及其同屬植物作為研究對象，經干燥樣品研磨過100目篩，通過對粉末樣品的掃描，采集所有樣品的NIRS數據，應用TQ Anlyst 8.0化學計量軟件處理，結合SPSS 22.0統計軟件的系統聚類分析方法來對物種進行鑒定研究，建立了一種方便快捷、無損害的鑒定方法。

在對NIRS譜圖的分析中發現，由于樣品都屬于同屬物種，化學結構和化學組成都比較近似，因此原譜圖之間的差異不是很明顯，只發現在部分波數處(4 139.50～7 381.78 cm-1)具有微小的差異。通過對譜圖進行二階導數處理，此波數范圍內的吸收峰比原圖明顯，一些微小的變化二階導數圖比原圖更能說明問題。

葉部位的NIRS相似度比較和聚類分析結果顯示，小花清風藤與同屬植物間差異十分顯著，故可以通過對該屬植物葉的近紅外光譜的采集和分析，建立有效的小花清風藤與其同屬植物及藥材分類鑒別的快捷方法。對比小花清風藤與其他物種的1年生莖和老莖中的NIRS數據發現其相似度較高，不能完全區分開，說明該屬植物1年生莖和老莖的化學成分比較相似，NIRS數據不適宜作為該屬植物的分類鑒別依據，這可能是因為清風藤屬大部分物種屬于多年生落葉植物，葉的生長周期較短，因而種內化學成分相對穩定，而種間又有所差異。1年生莖和老莖的生成周期較長，即使是同一種植物，可能由于生長期和采集時間的不同，會導致莖中的化學成分有所差異。