CLP膿毒血癥模型肝組織損傷芯片中差異基因及潛在通路分析

王永祥，張子建，劉如石，熊 力，劉 鍇，黃云鵬，陽(yáng) 楊，陳 丹，文 宇*

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院普外科， 長(zhǎng)沙 410011； 2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410006；3.珠海市人民醫(yī)院急診科， 珠海 519000)

膿毒血癥是一種可以導(dǎo)致嚴(yán)重的多器官功能障礙綜合征的致死性臨床疾病。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在抗生素治療、呼吸機(jī)管理、復(fù)蘇策略和血糖維持等方面的快速發(fā)展大大提高了膿毒血癥的預(yù)防、診療水平，但嚴(yán)重的膿毒血癥仍是各臨床科室面臨的最棘手的問(wèn)題之一[1]。膿毒血癥早期被簡(jiǎn)單地定義為病原體引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，但近年來(lái)膿毒血癥被認(rèn)為是宿主對(duì)包含感染、創(chuàng)傷、應(yīng)激在內(nèi)的各類反應(yīng)失調(diào)引起的器官功能障礙[2]。有資料顯示，多器官功能障礙在膿毒血癥患者并發(fā)癥中占40%～60%，普通抗感染治療和支持治療難以有效預(yù)防器官衰竭，因此治療效果不佳[3]。膿毒血癥可繼發(fā)于多種疾病，在腹部外科中，外科手術(shù)、肝膿腫、膽管炎、重癥胰腺炎等均可誘發(fā)炎癥反應(yīng)過(guò)度活化、免疫系統(tǒng)紊亂、凝血功能障礙，繼而導(dǎo)致膿毒血癥[4-6]。因此，針對(duì)腹部外科的膿毒血癥防治尤為重要。也正是如此，脂多糖(1ipopolysacharide，LPS)或盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP)常被作為膿毒血癥經(jīng)典模型來(lái)研究。本文旨在對(duì)大鼠、小鼠CLP膿毒血癥模型進(jìn)行分析[7]，從模式動(dòng)物的角度發(fā)現(xiàn)膿毒血癥造成肝臟組織損傷的潛在基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為膿毒血癥肝損傷早期的精準(zhǔn)診段和基因靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本研究首先從NCBI-Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI-GEO)下載2個(gè)原始微陣列數(shù)據(jù)集GSE1781，GSE510(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，共列入6例(GSM2405、GSM2406、GSM2407、GSM30472、GSM30473、GSM30474)CLP膿毒血癥模型和6例(GSM30469、GSM30470、GSM30471、GSM2402、GSM2403、GSM2404)假手術(shù)組數(shù)據(jù)[8,9]。接著使用R軟件(version 3.6.2)對(duì)高通量功能基因組表達(dá)的原始數(shù)據(jù)(小鼠Clontech Atlas Mouse cDNA Expression Array；大鼠Affymetrix Rat Expression 230A Array)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)limma包篩選了差異基因(different expression genes，DEGs)，將統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的DEGs定義為P<0.05和[log2FC]>0.56作為截止標(biāo)準(zhǔn)，其中FC(fold change)為差異倍數(shù)。隨后基于基因本體論和通路富集，通過(guò)DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)和KEGG pathway(http：//www.genome.jp/kegg)數(shù)據(jù)庫(kù)分析篩選DEGs。為確定膿毒血癥肝損傷模型中功能、通路的潛在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進(jìn)一步使用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)模塊分析整合了重要候選基因和通路。首先,使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)String(http：//string-db.org)獲取DEGs編碼的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)信息。其次，基于上述信息的關(guān)聯(lián)程度，使用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)MCODE(molecular complex detection)模塊分析膿毒血癥中編碼蛋白質(zhì)的候選DEGs的相互作用關(guān)系，使用網(wǎng)絡(luò)分析器插件來(lái)計(jì)算節(jié)點(diǎn)度，篩選具有重要生理調(diào)節(jié)功能的核心蛋白質(zhì)和關(guān)鍵候選基因，為膿毒血癥早期診斷以及個(gè)體化的預(yù)防和治療提供更準(zhǔn)確、實(shí)用的生物標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠膿毒血癥肝組織損傷芯片差異基因分析

利用大鼠構(gòu)建CLP膿毒血癥模型和假手術(shù)模型，留取對(duì)應(yīng)肝組織進(jìn)行差異基因芯片檢測(cè)。通過(guò)篩選獲得350個(gè)1.5倍及以上的上調(diào)表達(dá)基因(Log2FC≥0.56,P<0.05)，其中170個(gè)基因上調(diào)2倍及以上(Log2FC≥1,P<0.05)，17個(gè)基因(Lcn2,Ntf3,Pla2g2a,LOC100911545///A2m,Spink3,Lss,Spink3,Atpif1,Arpp21,Lss,Itgb3bp,Nfyb,Zfhx2,Acat2,Neb,Sqle,Slc1a2)上調(diào)4倍及以上(Log2FC≥2,P<0.05)。其中差異表達(dá)最顯著的是人中性粒細(xì)胞明膠酶(lipocalin 2,Lcn2)，其上調(diào)表達(dá)約達(dá)27倍(Log2FC=4.76,P<0.01)，為肝組織功能損傷的標(biāo)志物之一[10,11]。在大鼠膿毒血癥肝組織下調(diào)表達(dá)1.5倍以上的基因有1 337個(gè)(Log2FC ≤-0.56,P<0.05)，其中822個(gè)基因下調(diào)2倍及以上(Log2FC≤-1,P<0.05)，231個(gè)基因下調(diào)4倍及以上(Log2FC≤-2,P<0.05)，6個(gè)基因(Tnnt1,Sv2a,Grip1,Pitx2,Rbbp9,Kitlg)下調(diào)16倍以上(Log2FC≤-4,P<0.05)。

圖1 大鼠CLP誘導(dǎo)的膿毒血癥肝組織差異表達(dá)基因聚類圖和火山圖Fig.1 Gene map of differentially expressed genes in liver tissue of sepsis induced by CLP in rats(a)聚類圖；(b)火山圖。|Log2FC|≥1,-Log10 P>4(a)The clustering diagram;(b)The volcano diagram. |Log2FC|≥1,-Log10 P>4

2.2 小鼠膿毒血癥肝組織損傷芯片差異基因分析

利用小鼠構(gòu)建CLP膿毒血癥和假手術(shù)模型，留取對(duì)應(yīng)肝組織進(jìn)行差異基因芯片檢測(cè)。通過(guò)篩選獲得3 532個(gè)1.5倍及以上的上調(diào)表達(dá)基因(Log2FC≥0.56,P<0.05)，其中2 030個(gè)基因上調(diào)2倍及以上(Log2FC≥1,P<0.05)，669個(gè)基因上調(diào)4倍及以上(Log2FC≥2,P<0.05)，112個(gè)基因上調(diào)16倍以上(Log2FC≥4,P<0.05)，29個(gè)基因上調(diào)64倍以上(Log2FC≥6,P<0.05)，10個(gè)基因(A2m、Serpine1、Cd14、Slc10a6、Tifa、Il1rn、Cxcl1、Saa3、Cidec、Inhbb)上調(diào)128倍以上(Log2FC≥7,P<0.05),如由肝星狀細(xì)胞TLR4依賴性分泌的中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL1介導(dǎo)肝臟對(duì)腸微生物群的反應(yīng)[12]。在小鼠膿毒血癥肝組織下調(diào)表達(dá)1.5倍以上的基因有4 020個(gè)(Log2FC≤-0.56,P<0.05)，其中2 374個(gè)基因下調(diào)2倍及以上(Log2FC≤-1,P<0.05)，638個(gè)基因下調(diào)4倍及以上(Log2FC≤-2,P<0.05)，58個(gè)基因下調(diào)16倍以上(Log2FC≤-4,P<0.05)，8個(gè)基因 (Gck、Keg1、Nr0b2、Angptl8、Car3、Etnppl、Cyp7a1、Hsd3b3)下調(diào)64倍以上(Log2FC≤-6,P<0.05)。

2.3 大、小鼠膿毒血癥肝組織共同差異表達(dá)基因及其互作網(wǎng)絡(luò)

在大鼠和小鼠膿毒血癥肝組織中，對(duì)上述芯片結(jié)果的差異基因取交集，得到共同上調(diào)表達(dá)1.5倍以上(Log2FC≥0.56,P<0.05)的基因29個(gè) (Timp1、Gpr146、Pgs1、Lcn2、Cux1、Ell2、Fabp5、Cflar、Rrp15、Nfyb、Mid1、Fam134b、Abhd13、Celf2、Flna、Orm1、Mtss1、Slc41a1、Gnat1、Jund、Synrg、S100a9、Gskip、Tra2b、Lbp、Cp、Pcm1、Srsf10、Gosr1)。84個(gè)基因(Nrep、Prkag2、Hsf4、Nudt8、Pxdn、Rbms2、Rasgrp2、Cryl1、Vezt、Man2b1、Gclm、Vapb、Map2k5、Whsc1、Zfand4、Mrps6、Pcbp4、Camta1、Gucy1b3、S1pr5、Acot4、Htatip2、Hlf、Asrgl1、Usp21、Eci1、Bdnf、Mettl7b、Tspan2、Kctd2、Kidins220、Aldh1a1、Tbc1d2b、Thap11、Aifm3、Lancl1、Eno3、Frmd4b、Osbpl2、Ghdc、Bmp6、Mn1、Lrpap1、Abcg8、Clock、Nr0b2、Cnpy4、Hadh、Aaed1、Tbx3、Mapk3、Cyb561a3、Tmem98、Lzts3、Slc8b1、Stat6、Atxn7l1、Tnxb、Zdhhc18、Foxo4、Plxnd1、Pla2g15、Bcl2l12、Kifap3、Fam162a、Pter、Ptk2b、Myh10、Zfp444、Mxi1、Cuedc2、Mmaa、Ccpg1os、Gclc、Atp2c1、Abcb4、1-Mar、Ankrd24、Edc3、Stox2、Coq9、Pik3r2、Rfxank、Vmac)下調(diào)表達(dá)1.5倍以上(Log2FC ≤-0.56,P<0.05)。為進(jìn)一步分析差異蛋白質(zhì)的功能，將這113個(gè)基因在String數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并通過(guò)cytoscape軟件對(duì)上述PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步成分分析及可視化。

圖2 小鼠CLP誘導(dǎo)的膿毒血癥肝組織損傷差異表達(dá)基因聚類圖和火山圖Fig.2 Differentially expressed genes of sepsis-induced liver injury in mice with CLP (a)聚類圖；(b)火山圖。|Log2FC|≥1,-Log10 P>6(a)The clustering diagram;(b)The volcano diagram. |Log2FC|≥1,-Log10 P>6

表1 大鼠與小鼠CLP膿毒血癥模型肝組織芯片TOP5差異基因
Tab.1 TOP5 DEGs in liver tissue of rat and mouse CLP sepsis models

RegulationGene symbolOfficial full nameLocationSpeciesUpLcn2Lipocalin 2Chr3:11414189-11417534Rattus norvegicusUpNtf3Neurotrophin 3Chr4:158636883-158705886Rattus norvegicusUpPla2g2aPhospholipase A2 group IIAChr5:157282650-157285295Rattus norvegicusUpLOC100911545///A2mAlpha-2-macroglobulin-likeChr4:154422862-154473042Rattus norvegicusUpSpink3Serine peptidase inhibitor, Kazal type 3Chr18:38221919-38242092Rattus norvegicusUpA2mAlpha-2-macroglobulinChr6:121636165-121679238Mus musculusUpSerpine1Serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade E, member 1Chr5:137061504-137072272Mus musculusUpCd14CD14 antigenChr18:36725064-36726815Mus musculusUpSlc10a6Solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 6Chr5:103605711-103629403Mus musculusUpTifaTRAF-interacting protein with forkhead-associated domainChr3:127788875-127798394Mus musculusDownTnnt1Troponin T1, slow skeletal typeChr1:72889270-72899629Rattus norvegicusDownSv2aSynaptic vesicle glycoprotein 2aChr2:198321100-198336889Rattus norvegicusDownGrip1Glutamate receptor interacting protein 1Chr7:64672723-64854939Rattus norvegicusDownPitx2Paired-like homeodomain 2Ch2:233602732-233621059Rattus norvegicusDownRbbp9RB binding protein 9, serine hydrolaseChr3:138701579-138708332Rattus norvegicusDownGckGlucokinaseChr11:5900816-5950081Mus musculusDownKeg1Kidney expressed gene 1Chr19:12695790-12719902Mus musculusDownNr0b2Nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2Chr4:133553376-133556686Mus musculusDownAngptl8Angiopoietin-like 8Chr9:21835510-21837347Mus musculusDownCar3Carbonic anhydrase 3Chr3:14863538-14872381Mus musculus

圖3 CLP誘導(dǎo)的膿毒血癥肝組織損傷差異表達(dá)蛋白相互作用圖Fig.3 Interaction diagram of differentially expressed proteins in sepsis-induced liver tissue injury induced by CLP(a)所有差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；(b)核心互作網(wǎng)絡(luò)。紅色圓圈表示上調(diào)，藍(lán)色圓圈表示下調(diào)(a)The interaction network of all differential genes;(b)The core interaction gene.Red circles indicate up-regulation and blue circles indicate down-regulation

2.4 共同差異基因功能和通路分析

通過(guò)對(duì)上述共同差異基因從生物過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和KEGG通路4個(gè)角度的基因功能分析，發(fā)現(xiàn)20種生物過(guò)程、7類分子功能及5類細(xì)胞組分與膿毒血癥肝組織有潛在調(diào)控關(guān)系。其中，TOP3生物過(guò)程包含的基因數(shù)分別為8、7、7(表2)，且均與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄功能相關(guān)；TOP3分子功能包含的基因數(shù)分別為5、5、3(表2)，分別與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活、核酸或ADP結(jié)合相關(guān)；TOP3細(xì)胞組分包含的基因數(shù)分別為13、7、4(表2)，分別與細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體相關(guān)，這3類基因功能共同提示細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的激活、修飾及能量供給在膿毒血癥肝組織中具有重要作用。

圖4 GO分析及KEGG通路分析Fig.4 GO analysis and KEGG pathway analysis(a)生物過(guò)程(GO-BP)；(b)分子功能(GO-MF)；(c)細(xì)胞組分(GO-CC)；(d)KEGG通路(a)Biological process(GO-BP);(b)Molecular function (GO-MF);(c)Cell component (GO-CC);(d)KEGG pathway

表2 膿毒血癥模型的肝組織基因芯片經(jīng)GO和KEGG分析后TOP3功能和通路
Tab.2 TOP3 functions or pathway of liver tissue gene microarrays in sepsis model after GO and KEGG analysis

GeneFunction or pathwayBiological processCellular componentMolecular functionKEGG pathway Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoterNegative regulation of transcription from RNA polymerase II promoterTranscriptionNucleoplasmEndoplasmic reticulumMitochondrial inner membraneNucleotidebindingSignal transducer activityADP bindingMAPK signalingpathwayNeurotrophin signaling pathwayHIF-1 signaling pathwayStat6JundHsf4Foxo4Bcl2l12RfxankPik3r2Bmp6Stat6JundWhsc1Nr0b2Hsf4Cux1Bmp6Stat6Tbx3JundNr0b2HSF4Foxo4Cux1Stat6Cuedc2Htatip2Ptk2bUsp21VeztHsf4Foxo4HadhCux1RfxankThap11ClockPgs1PxdnAifm3Kifap3Tmem98GhdcLrpap1EcI1Aifm3Coq9HadhSrsf10Tra2bRbms2Celf2Gucy1b3Stat6Gnat1Ptk2bAtp2c1FlnaGclcPrkag2Myh10BdnfJundMapk3Rasgrp2FlnaMap2k5BdnfMapk3Kidins220Pik3r2Map2k5Mapk3Eno3Pik3r2Timp1

對(duì)上述共同差異基因從通路富集角度分析，發(fā)現(xiàn)共有10條通路與膿毒血癥肝組織關(guān)系密切，其中最主要的通路為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，這與PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的中心節(jié)點(diǎn)MAPK3一致，另外HIF-1、FoxO、乙型肝炎、血小板激活及膽汁分泌等通路調(diào)控也與膿毒血癥相關(guān)。

3 討論

在過(guò)去的幾十年中，許多基礎(chǔ)和臨床研究一直試圖揭示膿毒血癥形成和發(fā)展的新型、潛在機(jī)制，但是在世界范圍內(nèi)，腹部外科領(lǐng)域的膿毒血癥的死亡率仍然居高不下，因?yàn)榇蠖鄶?shù)研究一直集中在抗生素抗感染、免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)控免疫細(xì)胞和炎癥因子上，但在多器官功能衰竭的器官本身是如何代謝、衰竭的機(jī)制上，認(rèn)識(shí)還不夠清楚。為了進(jìn)一步補(bǔ)充膿毒血癥診療上的潛在新機(jī)制，本研究整合了來(lái)自不同研究團(tuán)隊(duì)的大鼠、小鼠芯片數(shù)據(jù)集，利用生物信息學(xué)方法對(duì)這些數(shù)據(jù)集進(jìn)行了深入分析。在第一步中，雖然大鼠(圖1)與小鼠(圖2)非常相近，但并非完全同源，無(wú)法簡(jiǎn)單的合并芯片中注釋的基因表達(dá)量結(jié)果，因此分別確定了兩組研究的DEGs，其中大鼠CLP膿毒血癥模型中有1 687個(gè)差異1.5倍以上、992個(gè)差異2倍以上的DEGs(170個(gè)上調(diào)2倍和822個(gè)下調(diào)2倍以上)；小鼠盲腸穿刺膿毒血癥模型中有7 552個(gè)差異1.5倍以上、4 404個(gè)差異2倍以上的DEGs(2 030個(gè)上調(diào)2倍和2 374個(gè)下調(diào)2倍以上)。在第二步中，將上述DEGs注釋取同源基因后獲取交集，并使用多種方法通過(guò)GO將DEGs分為3類(分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞成分組)，并分別聚類，得出潛在的差異基因最有可能影響的功能和通路。在第三步中，研究了DEGs蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體(圖3)，并從PPI網(wǎng)絡(luò)中濾出了最重要的模塊，鑒定出該模塊中，包含7個(gè)中心節(jié)點(diǎn)，這些基因與MAPK通路調(diào)控的各類細(xì)胞增殖[13]、代謝[14]、自噬[15]等過(guò)程密切相關(guān)。

通過(guò)綜合的生物信息學(xué)分析，已經(jīng)確定了7個(gè)中心節(jié)點(diǎn)，并由這7個(gè)節(jié)點(diǎn)的蛋白潛在互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)組成了一個(gè)模塊(圖3b)，包括Lcn2、ORM1、CP、TIMP1、MAPK3、NROB2、JUND。其中，Lcn2和MAPK3位于變化最大的基因頂部，并且它們翻譯的蛋白生物學(xué)功能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理或病理過(guò)程。MAPK 通路作為從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，已有諸多文獻(xiàn)表明在膿毒血癥中發(fā)揮著重要作用。膿毒血癥期間MAPK通路基因表達(dá)上調(diào)并持續(xù)存在，TLR4-TLR9-p38 MAPK-STAT3信號(hào)通路的激活有助于CLP誘導(dǎo)的膿毒血癥中miR-23b的產(chǎn)生[16]。miRNA介導(dǎo)的MAPK也被證實(shí)廣泛參與膿毒血癥調(diào)控中，miRNA-143與漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1 (plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)結(jié)合可上調(diào)MAPK-NF-κB途徑，從而調(diào)節(jié)膿毒血癥心臟功能并促進(jìn)炎性因子的分泌[17]；膿毒血癥患者的血清中miR-135a明顯上調(diào)，miR-135a的上調(diào)可加重?cái)⊙Y誘導(dǎo)的炎癥和心肌功能障礙，SB203580或JSH-23(MAPK通路抑制劑)可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象，證實(shí)p38 MAPK-NF-κB途徑介導(dǎo)了膿毒血癥的炎癥調(diào)控[18]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA也可發(fā)揮類似作用，Chen等[19]在膿毒血癥對(duì)心功能影響的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)通過(guò)激活p38 MAPK-NF-κB信號(hào)途徑誘導(dǎo)了CLP模型的心功能障礙和心肌炎癥，這是通過(guò)與miR-125b和p38 MAPK-NF-κB相互作用實(shí)現(xiàn)的。用葉黃素、類胡蘿卜素、蝦青素預(yù)處理小鼠原始巨噬細(xì)胞可以在體外抑制MAPK-NF-κB信號(hào)通路，并減弱LPS增加的炎癥因子。在LPS引起的膿毒血癥急性肺損傷的動(dòng)物模型中，蝦青素的使用顯著提高了存活率并降低了肺損傷程度，并被證明在體內(nèi)抑制了LPS誘導(dǎo)的炎癥因子增加、MAPK磷酸化和NF-κB活化[20]。

與本研究一致，一些研究也報(bào)道了膿毒血癥中Lcn2的重要作用。Lcn2蛋白屬于先天性免疫蛋白，其在體內(nèi)鐵平衡、感染和炎癥中發(fā)揮作用[21]。有研究認(rèn)為L(zhǎng)cn2亦屬于中性粒相關(guān)基因，這與本文中通路分析相符[22]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，Lcn2是LPS外圍給藥后中樞系統(tǒng)升高最多的蛋白質(zhì)，通過(guò)Lcn2基因雙敲小鼠，研究者確定了Lcn2對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥模型具有抗炎保護(hù)作用，而這種保護(hù)途徑依賴于細(xì)胞因子和趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，核苷酸結(jié)合寡聚化域樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子等途徑[23]。對(duì)于消化系統(tǒng)，Lcn2被證明在無(wú)菌小鼠血清和糞便中的含量顯著降低，而通過(guò)口服管飼野生型小鼠的盲腸內(nèi)含物可增加無(wú)菌小鼠血清Lcn2水平。反之,低表達(dá)Lcn2的小鼠表現(xiàn)出腸道細(xì)菌性營(yíng)養(yǎng)不良，細(xì)菌負(fù)擔(dān)增加，革蘭氏陰性細(xì)菌的比例增加。這說(shuō)明Lcn2本身可被微生物誘導(dǎo)，可能是維持微生物穩(wěn)態(tài)的先決條件[24]。氧化應(yīng)激也被認(rèn)為是破壞腸源性膿毒血癥腸道屏障的主要因素之一， Lcn2被證明在體外對(duì)H2O2毒性具有保護(hù)作用[25]。此外，體內(nèi)存在或使用Lcn2會(huì)引起炎癥性低鐵血癥和體內(nèi)抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(SOD)和血紅素氧合酶1(HO-1)]的上調(diào)，以限制敗血癥期間鐵引起的氧化應(yīng)激[26]。換句話說(shuō)，Lcn2可以防止氧化應(yīng)激并幫助減輕腸屏障損傷。Lcn2與MAPK3在本研究中是關(guān)鍵模塊中最重要的兩個(gè)基因，因此二者間可能有潛在聯(lián)系。在結(jié)直腸癌中，敲低Lcn2mRNA表達(dá)可通過(guò)p38 MAPK-CHOP依賴性途徑上調(diào)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，增加抗腫瘤活性[27]。在肥胖和2型糖尿病中，Lcn2表達(dá)增加，這依賴于脂肪細(xì)胞中γ-干擾素(interferon γ,IFNγ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)的轉(zhuǎn)錄依賴性誘導(dǎo)。Zhao等[28]證實(shí)，MAPK(ERK 1/2)激活是IFNγ和TNFα誘導(dǎo)Lcn2蛋白表達(dá)所必需的，IFNγ和TNFα分別誘導(dǎo)克隆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)和NF-κB促進(jìn)Lcn2轉(zhuǎn)錄。從上述文獻(xiàn)來(lái)看，MAPK3可能作為上游分子，啟動(dòng)并調(diào)控Lcn2蛋白的表達(dá)及功能。

膿毒血癥的的肝損傷特征涉及多種信號(hào)通路的基因和表觀遺傳調(diào)控，并導(dǎo)致肝組織中出現(xiàn)顯著的轉(zhuǎn)錄和翻譯差異。雖然本文的微陣列芯片結(jié)果只納入了基因轉(zhuǎn)錄水平差異，但此表達(dá)譜中仍可挖掘出膿毒血癥肝損傷的潛在特征。本研究只納入了基因表達(dá)量水平的研究分析，但根據(jù)前述，臨床癥狀表型的差異還應(yīng)該考慮更多的分子調(diào)控因素，包括基因突變、DNA或RNA甲基化水平、非編碼RNA水平和微衛(wèi)星變異等，這些因素都可能會(huì)導(dǎo)致或參與膿毒血癥的發(fā)生，并與預(yù)后密切相關(guān)。此外，簡(jiǎn)單的盲腸穿孔模型造模大多為革蘭陰性菌類別的膿毒血癥，LPS是其主要致病毒素，因此一定程度上僅能代表此類別下疾病診療的研究結(jié)論。而來(lái)自革蘭陽(yáng)性菌的脂磷壁酸(1ipoteichoic acid，LTA)和來(lái)自真菌的磷脂酰甘露聚糖(phospholipomannan，PLM)則會(huì)通過(guò)不同的方式激活并被免疫細(xì)胞識(shí)別[29]。免疫狀態(tài)也與膿毒血癥相關(guān)，Meakins等[30]首先發(fā)現(xiàn)部分膿毒血癥和外傷患者對(duì)通常的回憶抗原如麻疹和流行性腮腺炎病毒的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity response，DHT)缺失，遲發(fā)型超敏反應(yīng)缺失與死亡相關(guān)。但是，尚未完全了解膿毒血癥的每個(gè)亞型中的分子變化。

總之，本文通過(guò)使用多個(gè)芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定了膿毒血癥中發(fā)生改變的部分基因，篩選了7個(gè)最關(guān)鍵的中樞基因，這些基因中最重要的MAPK3和Lcn2主要與MAPK通路、中性粒細(xì)胞激活通路和缺氧誘導(dǎo)因子通路等相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)有利于對(duì)膿毒血癥肝衰竭的病因和潛在分子機(jī)制的理解，上述基因和通路可以作為治療靶標(biāo)用于后續(xù)研究。