組織因子及其可溶性剪切體在結腸癌組織中的表達及臨床意義

胡麗超　李佳麗　楊占甲　王敬真　程自想　高凱

[摘要] 目的 探討組織因子（membrane-bound full-length，flTF）及其可溶性剪切體（alternatively spliced tissue factor， asTF）在結腸癌組織中的表達，并分析其臨床意義。方法 ?采用RT-PCR方法檢測2015年7月—2018年12月方便選取在鄭州人民醫院行結腸癌切除術的42例患者的結腸癌組織及癌旁正常組織中flTF及asTF mRNA表達水平，并分析與腫瘤轉移力的影響。結果 結腸癌組織中flTFmRNA表達水平[5.53（4.80～13.32）]高于癌旁組織[0.36（0.02～1.21）]，差異有統計學意義;結腸癌組織中asTFmRNA表達水平[1.26（0.74～2.02）]高于癌旁組織[0.11（0.06～0.57）]，差異有統計學意義（P<0.05）。伴有遠處轉移的結腸癌組織中flTF的表達水平[8.64（5.98～12.71）]高于無轉移的結腸癌組織（2.25（1.57～5.32）、有遠處轉移的結腸癌組織中asTF表達水平[5.19（4.96～7.84）]高于無轉移組（0.67（0.23～1.08）），差異有統計學意義（P<0.05）。結論 flTF及asTF在結腸癌中組織中異常高表達，并與結腸癌侵襲與轉移相關。

[關鍵詞] 組織因子;可溶性剪切體;結腸癌

[中圖分類號] R735 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-0742（2020）04（c）-0010-03

Expression and Clinical Significance of Tissue Factor and Its Soluble Spliceosome in Colon Cancer

HU Li-chao， LI Jia-li， YANG Zhan-jia， WANG Jing-zhen， CHENG Zi-xiang， GAO Kai

Department of Blood Transfusion， Zhengzhou People's Hospital， Zhengzhou， Henan Province， 450003 China

[Abstract] Objective To investigate the expression of tissue factor （membrane-bound full-length （flTF） and its alternative spliced tissue factor （asTF） in colon cancer tissues， and analyze its clinical significance. Methods RT-PCR was used to detect the expression levels of flTF and asTF mRNA in colon cancer tissues and adjacent normal tissues of 42 patients who were conveniently selected and underwent colon cancer resection at Zhengzhou People's Hospital from July 2015 to December 2018. Influence of transfer force. Results The expression level of flTFmRNA[5.53（4.80～13.32）] in colon cancer tissues was higher than that in adjacent tissues[0.36（0.02～1.21）]， and the difference was statistically significant（P<0.05）; the expression level of asTFmRNA in colon cancer tissues[1.26（0.74～2.02）]， higher than adjacent tissues [0.11（0.06～0.57）]， and the difference was statistically significant. The expression level of flTF [8.64 （5.98 ～ 12.71）] in colon cancer tissues with distant metastasis was higher than that in colon cancer tissues without metastasis [2.25 （1.57～5.32）] and colon cancer tissues with distant metastases. The level （5.19 （4.96～7.84）） was higher than that in the non-metastatic group （0.67 （0.23～1.08））， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion flTF and asTF are abnormally highly expressed in colon cancer tissues， and are associated with colon cancer invasion and metastasis.

[Key words] Tissue factor; Soluble spliceosome; Colon cancer

組織因子（tissue factor， TF），又稱組織凝血活酶或凝血因子III，作為外源性凝血途徑的啟動因子參與機體凝血過程，此外作為凝血系統中唯一在細胞表面的跨膜糖蛋白，具有受體特性并發揮許多非凝血功能。研究發現組織因子常異常表達于多種腫瘤細胞表面，跨膜的全長組織因子（membrane-bound full-length，flTF）和亞型異常剪接組織因子（alternatively spliced tissue factor， asTF）均可影響腫瘤多種病理過程，如腫瘤相關血管生成、腫瘤相關血栓、腫瘤增值及遷移等[1]。該課題組前期結果發現結腸癌細胞株SW620高表達flTF，通過激活細胞表面PAR2受體促進結腸癌細胞的增值和遷移[2]，該研究方便收集2015年7月—2018年12月在鄭州人民醫院行結腸癌切除術的42例患者的結腸癌組織及癌旁正常組織，繼續探討flTF和asTF在結腸癌組織中的表達情況及對腫瘤侵襲和轉移的影響，報道如下。

1 ?資料與方法

1.1 ?一般資料

方便收集在鄭州人民醫院行結腸癌切除術的42例患者的結腸癌組織及癌旁正常組織（>3 cm），所有標本均經病理學確診，42例患者年齡36～67歲，平均年齡（47.7±8.5）歲，其中腺癌25例，鱗細胞癌12例，其他5例;發生遠處轉移者10例，未發生轉移者32例。

1.2 ?試劑

TRIzol購自Invitrogen公司，RIPA購自碧云天生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒購自Toyobo公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自康為世紀有限公司，ECL顯色試劑、PVDF膜購自Millipore公司。

1.3 ?方法

總RNA抽提及RT-qPCR的擴增：取100 mg結腸癌組織和癌旁組織分別加入1 mlTrizol試劑，徹底勻漿，按照試劑說明書提取總RNA，應用逆轉錄試劑盒合成cDNA，CFX96熒光定量PCR分析儀（美國Bio Rad公司）檢測flTF、asTF及β-actin mRNA表達水平。引物序列見表1，目的基因相對表達量為目的基因拷貝數與β-actin拷貝數的比值。

1.4 ?統計方法

應用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析。計量資料采用（x±s）表示，正態分布數據兩組間比較采用t檢驗，計數資料[n（%）]行χ2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 ?結果

2.1 ?結腸癌組織及癌旁組織中flTF mRNA的表達

采用實時定量PCR檢測42例結腸癌組織及癌旁組織中flTF mRNA的表達，結果顯示結腸癌組織flTF mRNA相對表達量5.53（4.80～13.32）明顯高于癌旁正常組織0.36（0.02～1.21），差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2 ?結腸癌組織及癌旁組織中asTF mRNA的表達

采用實時定量PCR檢測42例結腸癌組織及癌旁組織中asTF mRNA的表達，結果顯示結腸癌組織asTF mRNA相對表達量1.26（0.74～2.02）明顯高于癌旁組織0.11（0.06～0.57），差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3 ?結腸癌組織中TF的表達與結腸癌轉移的關系

比較42例結腸癌組織中有遠處轉移標本組與無轉移組中flTF及asTF的表達差異，結果顯示有轉移組flTF mRNA表達高于無轉移組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

3 ?討論

組織因子作為機體凝血過程的啟動子，也發揮許多非凝血功能，參與血管新生、炎癥、動脈粥樣斑塊形成等多種生理病理過程。大量研究表明TF異常表達在多種腫瘤細胞表面，如胰腺癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌中，TF可與凝血因子Ⅶ形成復合物（TF-FⅦ）激活細胞表面蛋白酶激活受體，促進腫瘤相關血管生成和腫瘤增殖，并與腫瘤的侵襲、遷移、預后及藥物抵抗等相關[3]。近年來新發現的組織因子異常剪接組織因子（alternatively spliced tissue factor，asTF），由于TF前體mRNA的整個第5號外顯子被異常剪切導致第6號外顯子編碼的跨膜區和胞漿區缺失，形成由206個氨基酸組成的可溶性的asTF。與flTF信號傳導和作用機制不同，asTF不參與凝血過程，卻可以通過與整合素家族結合促進腫瘤相關血管生成[4]。現有研究針對flTF的功能和作用機制研究較多，對asTF的作用研究較少，asTF在腫瘤進展中所起的作用和具體機制仍不明確。

該研究通過RT-PCR方法檢測結腸癌組織及癌旁正常組織flTF的表達，發現結腸癌組織中flTF mRNA[5.53（4.80～13.32）]較癌旁正常組織[0.36（0.02～1.21）]異常高表達，在有遠處轉移的結腸癌組織中flTF表達比癌旁正常組織中高4倍，差異有統計學意義（P<0.05）。Eriksson O通過免疫組織化學方法也證實結腸癌組織中高表達TF，Clouston HW體外培養結腸癌細胞株DLD-1發現其TF活性異常增強（10.5±5.23），該研究結果與其結果一致[5-6]。然而結腸癌組織中aTF表達水平還未有研究，該研究通過RT-PCR方法同時檢測結腸癌組織及癌旁組織的asTF mRNA水平并分析與腫瘤遠處轉移的關系，發現asTF也異常高表達于結腸癌組織中，并在有遠處轉移的結腸癌組織中更高表達，提示flTF及asTF的高表達都與結腸癌轉移密切相關，其是腫瘤進展的觸發因素還是結果及兩者之間的關聯還有待進一步研究探討。相繼有研究者發現TF亞型的高表達與其他腫瘤進展也有一定的關系，Wu M等[7]研究發現flTF及asTF均高表達于胃癌組織中[7.45（0.34～33.68）、0.88（0.07～26.00）]，高表達flTF及asTF的胃癌患者生存期較短，推測flTF及asTF表達水平是關系胃癌患者預后的獨立危險因素。Rollin等[8]在57例非小細胞肺癌患者中的臨床研究中發現腫瘤中asTF的高表達可縮短患者的生存時間;Kocaturk等[9]指出asTF與乳腺癌腫瘤的大小、分期密切相關。提示flTF及asTF可能作為臨床中監測腫瘤進展的危險因子。體內外研究表明運用TF亞型抗體能抑制胰管腺癌、乳腺癌、肺癌等的增殖和轉移，提示TF可能成為惡性腫瘤新的治療靶點。

[參考文獻]

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[2] ?胡麗超，周紅，武標，等.c-Jun/AP-1在因子Ⅶa促進SW620細胞增殖和遷移中的激活及其調控作用[J].江蘇醫藥，2013，39（7）：764-766.

[3] ?Graf C， Ruf W.Tissue factor asa mediator of coagulation and signaling in cancer and chronic inflammation[J].Thromb Res. 2018，164（1）：S143-S147.

[4] ?Hisada Y， Mackman N.TissueFactor and Cancer： Regulation， Tumor Growth， and Metastasis[J].Semin Thromb Hemost，2019，45（4）：385-395.

[5] ?Eriksson O，Asplund A，Hegde G，et al.A stromal cell popul ation in the large intestine identified by tissue factor expression that is lost during colorectal cancer progression[J].Thromb Haemost，2016，116（6）：1050-1059.

[6] ?Clouston HW，Rees PA， Lamb R， et al.Effect of Tissue Factor on Colorectal Cancer Stem Cells[J].Anticancer Res，2018，38（5）：2635-2642.

[7] ?Wu M， Chen L， Xu T，et al.Prognostic values of tissue factor and its alternatively splice transcripts in human gastric cancertissues[J].Oncotarget，2017，16（32）：53137-53145.

[8] ?Rollin J， Regina S， Gruel Y.Tumor expression of alternatively spliced tissue factor is a prognostic marker in non-small cell lung cancer[J].J Thromb Haemost，2010，8（3）：607-610.

[9] ?Kocatürk B， Tieken C， Vreeken D， et al.Alternatively spliced tissue factor synergizes with the estrogen receptor pathway in promoting breast cancer progression[J].J Thromb Haemost，2015，13（9）：1683-1693.

（收稿日期：2020-01-06）