膽木化學成分對HUVEC細胞活性氧和通透性的影響

麥世瑛 王怡然 李永輝 譚銀豐 張旭光 張俊清 李錦云

摘要?目的：研究膽木化學成分對HUVEC細胞通透性、ROS生成水平的影響，探討膽木對HUVEC的保護作用。方法：設有對照組和觀察組，通過FITC標記的右旋糖酐（Dextran）試劑盒檢測膽木成分對AngⅡ誘導HUVEC單層通透性的影響;以DCFH-DA試劑盒檢測膽木化學成分對ROS的抑制作用，采用LPS誘導HUVEC細胞的ROS。結果：膽木生物堿及酚酸類成分對LPS引起的ROS水平增加有抑制趨勢，10?μg/mL的喜果苷促進作用有統計學意義（P<0.05）。膽木成分具有促進HUVEC細胞通透性增加的作用，其中異常春花苷內酰胺、喜果苷和原兒茶酸對HUVEC細胞通透性有明顯的促進作用。結論：膽木抗炎作用可能與其促進活性氧生成及通透性增加有關。

關鍵詞?膽木;活性氧;通透性;ROS;烏檀;生物堿;酚酸;增殖

Effects?of?Chemical?Constituents?of?Nauclea?Officinalis?on?Reactive?Oxygen?Species?and?Permeability?of?HUVEC?Cells

MAI??Shiying1，WANG?Yiran1，LI?Yonghui1，TAN?Yinfeng1，ZHANG?Xuguang1，ZHANG?Junqing1，LI?Jinyun2

（1?Hainan?Provincial?Key?Lab?of?R&D?on?Tropic?Herbs，Hainan?Medical?University，Haikou?571199，China;?2?Hainan?Senqi?Pharmaceutical?Co.，Ltd，Haikou?570216，China）

Abstract?Objective：To?observe?the?effects?of?chemical?components?from?Nauclea?officinalis?on?the?HUVEC?monolayer?permeability?and?reactive?oxygen?species（ROS）production?induced?by?pro-inflammatory?factors，and?to?investigate?the?protective?effect?of?Nauclea?officinalis?on?HUVEC.Methods：A?control?group?and?an?experimental?group?were?set?up.FITC-Dextran?kit?was?used?to?detect?the?effects?of?components?from?Nauclea?officinalis?on?AngII-induced?HUVEC?monolayer?permeability;?DCFH-DA?kit?was?used?to?detect?the?inhabitation?effects?of?components?from?Nauclea?officinalis?on?ROS.The?ROS?in?HUVEC?cells?were?induced?by?LPS.Results：The?results?showed?that?the?composition?of?Nauclea?officinalis?inhibited?the?increase?of?ROS?induced?by?LPS，but?the?promotion?effect?of?10?μg/mL?of?vincosamide?was?significant.The?composition?of?Nauclea?officinalis?had?the?effects?of?promoting?the?increase?of?HUVEC?cell?permeability.Among?them，strictosamid，vincosamiide?and?protocatechuic?acid?had?significant?promoting?effects?on?HUVEC?cell?permeability.Conclusion：The?anti-inflammatory?effects?of?Nauclea?officinalis?may?be?related?to?the?promotion?of?active?oxygen?production?and?increased?permeability.

Keywords?Nauclea?officinalis;?Reactive?oxygen?species;?Permeability;?ROS;?Nauclea;?Alkaloids;?Phenolic?acid;?Proliferation

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.01.008

膽木（Nauclea?officinalis?Pierre?ex?Pitard.）為茜草科烏檀屬植物，又名烏檀、熊膽樹、黃膽木、山熊膽等，以枝、皮入藥，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，用于治療咽喉炎、支氣管炎、急性扁桃體炎等，有“植物抗生素”之稱，主要用于感冒中上呼吸道感染的預防和治療[1-2]。機體存在炎性反應時，前期損傷因子直接或間接造成組織和細胞的破壞[3-4];后期通過相關細胞的增殖、遷移與愈合等途徑促進炎性反應的修復[5]。高氧化活性的含氧自由基（ROS）作為調節細胞增殖的重要信號因子[6]，有研究表明其產量的適度增加能促進內皮細胞增殖[7]。因此本研究主要觀察膽木成分抗炎活性、活性氧水平、通透性之三者間的關系及膽木成分在其中發揮的作用。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細胞株?人臍靜脈內皮細胞（HUVEC細胞）購自上海哥凡生物科技有限公司（貨號GF067）。將HUVEC細胞維持在含有10%胎牛血清和10%肝素鈉的青霉素/鏈霉素補充的F-12k中，并在細胞培養箱（37?℃，95%空氣和5%CO2）中培養。每2～3?d更換培養基，并在匯合度達70%～80%時進行傳代培養，按1∶2或1∶3傳代。

1.1.2?藥物及試劑?綠原酸（批號PRF9012741，質量分數99.48%）購買于成都普瑞法科技開發有限公司，原兒茶酸（批號P104382-5?g，質量分數≥97%）購買于煉石商城;喜果苷、短小舌根草苷和異長春花苷內酰胺為本課題組分離得到（質量分數≥95%）。AngⅡ購買于煉石商城（貨號A800620-10?mg，純度：90%），胎牛血清（FBS）購自Gibco（美國，貨號16000044），PBS（美國Hyclone，貨號SH30256.01），F-12k培養液購自武漢博士德生物工程有限公司（貨號PYG0093），肝素鈉購自Solarbio（貨號H8060-1?g）;細胞生長因子（ECGS）（貨號KGY1052）購自南京凱基生物科技發展有限公司，青、鏈霉素混合液（Biosharp，貨號BL505A），胰蛋白酶（含EDTA）（美國Hyclone，貨號SH30042.01），CCK-8試劑盒（Biosharp），活性氧試劑盒（南京建成），LPS其他常用生化試劑均為國產分析純。各測試樣品以DMSO溶解并稀釋至合適濃度，-20?℃保存備用。水為去離子超純水。

1.1.3?儀器?LabTower?EDI15超純水一體機（美國賽默飛世爾科技）;RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）;KQ-100V超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;梅特勒XS105DU電子分析天平（瑞典梅特勒）;Waters?e2696/2996高效液相色譜儀;DZF-6053臺式真空干燥箱（上海藍豹）;LC-20A制備液相（日本島津）;Jasco?V-650紫外分光光度計（日本分光）;色譜柱為Waters?Symmetry?C18（4.6×150?mm，5?μm）;TGL-16G臺式高速離心機（上海安亭儀器廠）;CO2恒溫培養箱（美國，Thermo公司）;SPECTRA?MAX?190酶標儀（中國）;CKX41倒置顯微鏡（日本奧林巴斯）;蔡司VERT.A1倒置熒光顯微鏡（中國）。

1.2?方法

1.2.1?膽木成分的制備?膽木莖枝（4.7?kg）粉碎，用水提取（10?L/5?h/次，共3次），濃縮得浸膏118?g。分別用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取浸膏，濃縮后分別為19.6?g和16.7?g。經反復硅膠柱色譜，制備色譜等分離萃取浸膏，共得到5個化合物：喜果苷[8]，異常春花苷內酰胺[9]，短小蛇根草苷[10]，綠原酸[11]，原兒茶酸[12]。

1.2.2?采用CCK-8方法評價膽木化學成分對HUVEC細胞的促進增殖作用?參照文獻[13]，采用CCK-8的方法評價膽木化學成分對HUVEC細胞的促進增殖作用。具體方法：細胞以1.5×104個細胞/0.2?mL/孔的密度接種在96孔板中。分別取用不同濃度的樣品（濃度設定如圖1所示）或DMSO作為對照處理細胞，并在細胞培養箱中孵育。24?h后，棄掉舊培養液，向每個孔中加入100?μL?CCK-8稀釋液，并將平板再次放回培養箱，分別于1?h、2?h、3?h、4?h使用SPECTRA?MAX?190酶標儀（Molecular?Devices，China）測量450?nm處樣品的吸光度。

1.2.3?以FITC標記的右旋糖酐（Dextran）試劑盒檢測膽木成分對AngⅡ誘導HUVEC單層通透性的影響?將HUVEC用0.5%胰蛋白酶消化并制成密度為4×105/mL細胞懸液，各吸250?μL接種于試劑盒的嵌套小室內，將嵌套置于24孔培養板的小井中，小井中加入500?μL培養液，放入37?℃含5%?CO2濕度為95%～100%的孵箱內培養，嵌套和24孔培養板的小井構成2個相對隔離的小室：嵌套小室和外室。嵌套小室和外室可通過生長在嵌套小室的內皮細胞單層進行物質交換。嵌套小室上內皮細胞生長成致密連接狀態后，在嵌套小室內室更換新鮮含藥物（或樣品）的培養基（不含FBS）饑餓培養，模型組、空白組及外室更換成新鮮不含FBS的培養基。24?h后藥物組及模型組加入250?μL稀釋好（均用含2%?FBS的F-12k稀釋）的Ang?Ⅱ（10-6M），并設正常對照組（只加250?μL含2%?FBS的F-12k），加入稀釋好的FITC-Dextran作為通透性指示劑。分別于0.5?h、1?h、2?h、4?h后收集外室培養液，熒光酶標儀檢測激發波長488?nm，發射波長：530?nm的熒光值，n=3，內皮細胞單層對FITC-Dextran的相對通透率按以下公式計算（以模型組為對照），相對通透率=（藥物組-模型組）/（模型組-空白組）×100%。

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（2018-12-27收稿?責任編輯：芮莉莉）

基金項目：海南省自然科學基金項目（20168270）;海南省研究生創新研究項目（Hys2017-182）作者簡介：麥世瑛（1994.05—），女，碩士，藥師，研究方向：藥物活性成分研究，E-mail：854363381@qq.com通信作者：李永輝（1974.09—），男，博士，研究員，研究方向：藥物分析與聽代謝動力學研究，E-mail：lyhssl@126.com