阿薩伊及其醇提物對虛熱及虛寒證小鼠甲狀腺素及代謝水平的影響

周雪 樂娜 王玉杰 研 湯如瑩 王林元 張建軍

摘要?目的：通過考察阿薩伊醇提物對虛熱及虛寒證小鼠的溫度趨向性、環核苷酸、甲狀腺素及代謝水平的影響，探討阿薩伊寒涼藥性的物質基礎。方法：將昆明種雄性小鼠隨機分為空白組、虛熱模型組、虛熱+阿薩伊凍干原粉組、虛熱+阿薩伊醇提物組、虛寒模型組、虛寒+肉桂組、虛寒+阿薩伊凍干原粉組、虛寒+阿薩伊醇提物組。虛熱模型組小鼠每天下午灌胃給予甲狀腺片溶液160?mg/kg，虛寒模型組小鼠給予氫化可的松溶液25?mg/kg，連續14?d，各給藥組灌胃相應藥物，實驗結束后測定相關指標。結果：阿薩伊醇提物與寒涼性質的阿薩伊作用類似，與溫熱性質的肉桂作用相反，對虛熱模型小鼠作用比較明顯，而對虛寒模型無明顯改善作用。結論：該實驗采用同類比較，異類反證的方法，通過測定動物溫度趨向性、環核苷酸、甲狀腺激素與能量代謝水平等相關指標的含量變化，證明了阿薩伊醇提物為阿薩伊寒涼藥性的物質基礎。

關鍵詞?阿薩伊;阿薩伊醇提物;環核苷酸;溫度趨向性;甲狀腺素;代謝水平;物質基礎

Effects?of?ANai?Alcohol?Extract?on?Thyroxine?and?Metabolic?Level?of?Deficiency-Heat?and?Deficiency-Cold?Syndrome?in?Mice

ZHOU?Xue，LE?Na，WANG?Yujie，?QU?Yan，?TANG?Ruyin，?WANG?Linyuan，?ZHANG?Jianjun

（Beijing?University?of?Chinese?Medicine，?Beijing?100029，?China）

Abstract?Objective：To?investigate?the?temperature?tendency，?cyclic?nucleotides，?thyroxine?and?metabolic?level?of?Aaí?alcohol?extract?on?deficiency-heat?and?deficiency-cold?models?and?to?clarify?the?material?basis?of?the?cool?drug?properties?of?the?Aaí.Methods：KM?mice?were?randomly?divided?into?a?blank?group，?a?deficiency-heat?model?group，?a?deficiency-heat+Aaí?group，?a?deficiency-heat+Aaí?alcohol?extract?group，?a?deficiency-cold?model?group，?a?deficiency-cold+Cortex?Cinnamomi?group，?a?deficiency-cold+Aaí?group，?a?deficiency-cold+Aaí?alcohol?extract?group.The?mice?were?administered?orally?at?the?dose?of?160?mg/kg?thyroxine?and?25?mg/kg?hydrocortisone?on?the?afternoon?from?the?first?day?per?day?respectively?for?14?days?to?induce?deficiency-heat?and?deficiency-cold?models.Each?administration?group?was?given?the?corresponding?drug.At?the?end?of?the?experiment，?the?related?indexes?were?determined.Results：Aaí?alcohol?extract?had?the?same?effect?with?Aaí?on?deficiency-heat?model.In?contrast?to?Cortex?Cinnamomi，?there?was?no?significant?effect?on?the?deficiency-cold?model.Conclusion：In?this?study，?the?content?changes?of?temperature?tendency，?cyclic?nucleotide，?thyroid?hormone，?metabolism?and?other?related?indicators?were?preliminarily?determined?to?prove?that?the?alcohol?extract?of?Aaí?is?the?material?basis?of?Aaí?cold?medicine?by?the?methods?of?homogeneous?comparison?and?heterogeneous?disproval.

Keywords?Aaí;?Aaí?alcohol?extract;?Cyclic?nucleotides;?Temperature?tendency;?Thyroxine;?Metabolic?level;?Material?basis

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.01.009

阿薩伊為來源于棕櫚科植物阿薩伊棕櫚樹（Euterpe?oleraceae?Mart.）的新鮮果實，又名巴西莓，原產于南美地區[1]。2013年阿薩伊由國家衛生部引入中國[2]。我們依據中藥新資源藥性研究模式[3]，在密切追蹤阿薩伊現代研究進展基礎上，對其文獻采用數據庫技術進行全面整理并首次對阿薩伊進行系統的中醫藥理論分析，提出了阿薩伊的中藥藥性為涼，藥理學驗證了阿薩伊的寒涼藥性[4]。為了進一步探討阿薩伊寒涼藥性的物質基礎，對阿薩伊的化學成分進行提取分離，得到的醇提物中主要含花青素類和黃酮類成分，均具有很強的抗氧化、抗炎等作用。該實驗研究了阿薩伊醇提物對虛熱及虛寒證小鼠的溫度趨向性動物行為學表征、環核苷酸、甲狀腺素及代謝水平等生化指標的影響，以探討阿薩伊藥性的物質基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SPF級昆明種雄性小鼠112只，體質量18～22?g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2016-0002）。小鼠飼養于北京中醫藥大學動物房，整個實驗過程中小鼠自由飲水，室溫22～26?℃，相對濕度為60%～70%，燈照周期為12?h。

1.1.2?藥物?1）受試藥物：阿薩伊凍干原粉，由蒙維（上海）貿易有限公司提供。2）阿薩伊醇提物：取阿薩伊凍干原粉，經超臨界CO2萃取儀脫脂后，加入10倍量80%乙醇，超聲提取3次，每次超聲1?h，濾過，合并濾液，回收乙醇至無醇味，并配制成每毫升相當于0.2?g阿薩伊凍干原粉的受試物。3）造模藥：甲狀腺片（上海長城藥業有限公司，批號：20161101）;氫化可的松琥珀酸鈉（天津生物化學制藥有限公司，批號：021511075）。4）陽性藥：肉桂配方顆粒（北京康仁堂藥業有限公司，批號：16012323），實驗前用蒸餾水或生理鹽水配制成所需要的濃度。

1.1.3?試劑與儀器?環磷酸腺苷（cAMP）、環磷酸鳥苷（cGMP）放射免疫試劑盒（北京華英生物技術研究所，批號20180126），三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）放射免疫試劑盒（北京華英生物技術研究所，批號20180126），游離脂肪酸（FFA）試劑盒（北京華英生物技術研究所，批號20180126），總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號20180126），總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號20180126）。DR-200BS酶標分析儀（無錫華衛德朗儀器有限公司）;BS-420全自動生化儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）;XH-6020全自動放免計數儀（西安核儀器廠）;動物溫度趨向性行為學智能監測系統由解放軍302醫院自主設計（專利號ZL200820004444.2）（北京中交儀器公司協助研發）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?小鼠適應性喂養5?d，隨機分為空白組、虛熱模型組、虛熱+阿薩伊凍干原粉組（4?g/kg）、虛熱+阿薩伊醇提物組（折合生藥4?g/kg）、虛寒模型組、虛寒+肉桂組（37.5?g/kg）、虛寒+阿薩伊凍干原粉組（4?g/kg）、虛寒+阿薩伊醇提物組（折合生藥4?g/kg）8組，每組14只，每組分為兩籠飼養。實驗第1天開始，虛熱模型組小鼠每天下午灌胃給予甲狀腺片溶液160?mg/kg，虛寒模型組小鼠灌胃給予氫化可的松溶液25?mg/kg，1次/d，連續14?d，實驗第12、13、14天連續3?d測定小鼠溫度趨向性，第15天摘眼球取血，頸椎脫臼處死動物。

1.2.2?給藥方法?邊造模邊給藥，給藥體積為每10克體質量0.2?mL，按體質量變化調整灌胃量。空白組和虛熱模型、虛寒模型組給予等量生理鹽水，各組灌胃相應濃度的藥物，每日上午1次，共14?d。

1.2.3?檢測指標與方法?1）觀察實驗小鼠一般情況，體質量變化等;2）基于冷熱板示差法研究小鼠灌胃給藥后的溫度趨向性差異，即小鼠冷區/熱區停留比例;3）小鼠摘眼球取血，靜置2～3?h，3500?r/min離心15?min，吸取上層血清，采用放射免疫、比色等方法檢測各組小鼠血清中環磷酸腺苷（cAMP），環磷酸鳥苷（cGMP），cAMP/cGMP，三碘甲狀腺原氨酸（T3），甲狀腺素（T4），游離脂肪酸（FFA），總膽固醇（TC），三酰甘油（TG），總蛋白（TP），白蛋白（ALB）等指標的變化，因小鼠血清樣本有限，故每組血清樣本按籠數即7只分為兩部分檢測不同指標。

1.3?統計學方法

采用SPSS?20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，數據進行正態性和方差齊性檢驗，方差齊時組間數據采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett′s進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?對小鼠一般狀況的影響

與空白組比較，虛熱模型組小鼠出現大便干硬、小便發黃、自主活動增加、易被激惹、反應活躍等虛熱癥狀。虛寒模型組小鼠出現明顯消瘦、毛發無光澤、反應遲鈍、大便清稀、畏寒喜暖等虛寒癥狀。虛熱阿薩伊組對虛熱模型組以及虛寒肉桂組對虛寒模型組均有一定程度的改善，虛熱阿薩伊醇提物組對虛熱模型以及虛寒阿薩伊醇提物組虛寒模型組小鼠也有不同程度的改善。

2.2?阿薩伊及阿薩伊醇提物對虛熱模型、虛寒模型組小鼠體質量的影響

與空白組比較，實驗第14天，虛熱模型組體質量有明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;與虛熱模型組比較，虛熱阿薩伊組有所回升，差異有統計學意義（P<0.05），虛熱阿薩伊醇提物組也有所提高，差異有統計學意義（P<0.05）。

與空白組比較，實驗第7天、第14天，虛寒模型組體質量明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）;與虛寒模型組比較，虛寒肉桂組體質量高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3?阿薩伊及阿薩伊醇提物對虛熱模型、虛寒模型組小鼠溫度趨向性及環核苷酸水平的影響

與空白組比較，虛熱模型組冷區比例明顯上升，差異有統計學意義（P<0.05）;與虛熱模型組比較，虛熱阿薩伊組冷區比例顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），而虛熱阿薩伊醇提物組與虛熱阿薩伊組類似，亦能降低冷區停留比例，差異有統計學意義（P<0.05）;與空白組比較，虛熱模型組cAMP、cGMP、cAMP/cGMP均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與虛熱模型組比較，虛熱阿薩伊組cAMP、cGMP、cAMP/cGMP值均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），虛熱阿薩伊醇提物組也能明顯降低cAMP、cGMP、cAMP/cGMP值，差異有統計學意義（P<0.05）。

與空白組比較，虛寒模型組冷區比例明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），與虛寒模型組比較，虛寒肉桂組有所上升，差異有統計學意義（P<0.05）;與空白組比效，虛寒模型組cAMP、cAMP/cGMP均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05），cGMP明顯上升，差異有統計學意義（P<0.05）;與虛寒模型組比較，虛寒肉桂組cGMP明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4?阿薩伊及阿薩伊醇提物對虛熱模型、虛寒模型組小鼠甲狀腺激素水平的影響

與空白組比較，虛熱模型組T3明顯上升，差異有統計學意義（P<0.05）;與虛熱模型組比較，虛熱阿薩伊組T3顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），虛熱阿薩伊醇提物組與虛熱阿薩伊組類似，T3、T4均顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）。

與空白組比較，虛寒模型組T3、T4均有下降的趨勢;與虛寒模型組比較，虛寒肉桂組有升高的趨勢，虛寒阿薩伊組無變化，虛寒阿薩伊醇提物組T3、T4差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.5?阿薩伊及阿薩伊醇提物對虛熱模型、虛寒模型組小鼠代謝水平的影響

與空白組比較，虛熱模型組TC、TG、TP、FFA及白蛋白含量均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與虛熱模型組比較，虛熱阿薩伊組TC、TG、TP及白蛋白顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），虛熱阿薩伊醇提物組TC、TG、TP、FFA及白蛋白也均顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）。

與空白組比較，虛寒模型組TC、FFA及白蛋白含量均顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）;與虛寒模型組比較，虛寒肉桂組TC、FFA及白蛋白均有所回升，差異有統計學意義（P<0.05），阿薩伊組差異無統計學意義（P>0.05），虛寒阿薩伊醇提物組FFA有所上升，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3?討論

《神農本草經》云：“藥有寒熱溫涼”。中藥的寒熱屬性主要是從藥物作用于人體所獲得的不同反應總結而來，人體的寒熱變化可以通過藥性的寒熱溫涼來進行調節;藥物的作用也是從藥物臨床療效總結而得，“寒者熱之，熱者寒之”，從而糾正機體陰陽偏盛或偏衰的病理狀況。因而，病證的寒熱屬性是用藥的主要依據[5]。寒熱藥性的研究與中醫寒熱證候本質研究緊密相關，因此在動物實驗研究中，構建能夠體現臨床特征的動物證候模型尤為關鍵。根據文獻方法，以及前期實驗結果驗證，選取灌胃160?mg/kg的甲狀腺素和25?mg/kg的氫化可的松，連續14?d的方法誘導虛熱及虛寒模型[6-7]。

近年來，中藥藥性的研究成為熱點，有諸多學者運用多種方法，從不同角度對藥性理論展開了研究。有學者提出“藥性三要素”觀點，認為中藥的物質基礎作用于不同證候的動物而對其宏觀行為學及微觀生化指標的改變情況[8]。陰陽的偏盛偏衰使機體表現出寒熱證候，此時在機體對溫度的感知以及伴隨的行為等方面均會出現差異，如體溫、自主活動和對外界冷熱刺激的反應等。研究表明，機體環核苷酸水平、甲狀腺功能狀態及能量代謝水平等方面的不同，是造成寒熱證候存在不同外在表征的內在生理基礎，治療時可以遵循“療寒者熱藥，療熱者寒藥”的用藥原則，利用寒熱性中藥進行干預、調節機體功能，使相關指標從紊亂狀態恢復正常，從而達到調整寒熱體質或糾正寒熱證候的效果，以發揮中藥的有效性[9]。

實驗以宏觀動物行為學和動物熱活性角度為研究的切入點，結合計算機和現代影像處理技術，通過監測虛熱、虛寒證模型小鼠給予阿薩伊醇提物后對環境溫度趨向性行為的變化來評價阿薩伊醇提物的寒熱屬性。在本實驗中虛熱模型組冷區比例升高，虛熱阿薩伊及虛熱阿薩伊醇提物組均能使冷區比例下降，而虛寒阿薩伊及其醇提物對虛寒模型的冷區比例下降情況均無明顯改善作用，故從溫度趨向性看，阿薩伊醇提物性偏涼。研究表明環核苷酸水平可作為中藥寒熱藥性篩選的指標，其中有研究發現虛熱模型組cAMP、cAMP/cGMP均有所升高[10]，有研究在臨床研究中發現陽虛患者血漿cAMP降低，cGMP升高，cAMP/cGMP比值下降[11]。本研究中虛熱模型組cAMP、cGMP、cAMP/cGMP均代謝亢奮，虛熱阿薩伊、虛熱阿薩伊醇提物組均能抑制cAMP、cGMP、cAMP/cGMP水平。又因本實驗采用灌胃甲狀腺激素制備虛熱模型，故虛熱模型組T3、T4有所升高，虛熱阿薩伊及虛熱阿薩伊醇提物組均能抑制T3、T4水平。當機體處于虛熱狀態時除了激素分泌水平升高外，代謝功能也會增強，蛋白質、糖、脂代謝相關指標合成增加，而在虛寒狀態時則合成相對不足[12]。本實驗中虛熱模型組TC、TG、TP、FFA及白蛋白水平有所升高，虛熱阿薩伊及虛熱阿薩伊醇提物組均能不同程度的降低其水平，而虛寒阿薩伊及其醇提物對虛寒模型組相關指標的紊亂狀態均無明顯的改善作用。從環核苷酸、甲狀腺激素及代謝水平等指標變化情況來看，阿薩伊醇提物性偏涼。

綜上所述，本實驗通過制備虛熱、虛寒動物證候模型來“以證測性”，從體質量、溫度趨向性等動物行為學角度，環核苷酸水平、甲狀腺激素及代謝水平等內在生化指標等多方面來研究阿薩伊醇提物的寒熱藥性特點，結果表明阿薩伊醇提物與寒涼性質的阿薩伊作用類似，與溫熱性質的肉桂相反，對虛熱模型小鼠作用比較明顯，而對虛寒模型無明顯改善作用，因此按同類比較異類反證的方法推斷阿薩伊醇提物為阿薩伊寒涼藥性的物質基礎，阿薩伊中的其他類型的化學成分藥性如何還有待進一步實驗探索。

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（2019-04-12收稿?責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金項目（81173569）;北京中醫藥大學中青年教師自主課題（2018-JYBZZ-JS028、2016-JYB-JSPY-013）;北京中醫藥大學在讀研究生項目（2015-JYB-XS002）作者簡介：周雪（1993.08—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中醫臨床藥學，E-mail：13810986307@163.com通信作者：張建軍（1965.08—），女，博士，研究員，博士研究生導師，研究方向：基于中藥基本理論與臨床應用的藥效機理及物質基礎研究，E-mail：zjj59@163.com