大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的體內外遺傳毒性評價

文海若 顏玉靜 宋捷 鄂蕊 馬雙成 汪祺

摘 要 目的：評價大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（EG）的體內外遺傳毒性，并比較體外細胞試驗及大鼠體內實驗評價結果的差異。方法：采用體外二維（2D）、三維（3D）細胞培養法分別構建2D、3D HepaRG細胞模型，造模成功后，分別將2D、3D HepaRG細胞分為空白對照組[0.5%二甲基亞砜（DMSO）]、絲裂霉素C組（陽性對照，0.1 ?g/mL）和EG低、中、高劑量組（10、50、200 ?g/mL），然后檢測各組HepaRG細胞的微核形成率和尾DNA百分含量。將SD大鼠分為空白對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉）、甲磺酸乙酯組（陽性對照，200 mg/kg）和EG低、中、高劑量組（100、300、1 000 mg/kg），每組6只，連續灌胃給藥15 d，每天1次;15 d后檢測各組大鼠骨髓嗜多染紅細胞、肝細胞的微核形成率及外周血淋巴細胞、肝細胞的尾DNA百分含量、尾距。結果：在體外2D HepaRG細胞模型中，與空白對照組比較，絲裂霉素C組HepaRG細胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高（P<0.01），EG各劑量組HepaRG細胞的微核形成率和尾DNA百分含量差異無統計學意義（P>0.05）;在3D HepaRG細胞模型中，與空白對照組比較，絲裂霉素C組HepaRG細胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高（P<0.01或P<0.001），EG高劑量組HepaRG細胞的尾DNA百分含量顯著升高（P<0.01）。在大鼠體內實驗中，與空白對照組比較，甲磺酸乙酯組大鼠骨髓嗜多染紅細胞、肝細胞的微核形成率和外周血淋巴細胞、肝細胞的尾DNA百分含量、尾距均顯著升高（P<0.01），EG高劑量組大鼠外周血淋巴細胞尾DNA百分含量顯著升高（P<0.01），EG各劑量組大鼠骨髓嗜多染紅細胞、肝細胞的微核形成率和肝細胞尾DNA百分含量、尾距差異無統計學意義（P>0.05），但隨劑量增加有升高趨勢。結論：本研究結果提示在2D細胞模型中，EG未導致染色體斷裂及DNA損傷，但3D細胞模型長期給藥和體內重復給藥結果均顯示EG存在一定DNA損傷風險，故3D HepaRG細胞模型的評價結果更接近大鼠體內實驗結果。

關鍵詞 大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷;遺傳毒性;HepaRG細胞;二維培養;三維培養;大鼠;微核試驗

中圖分類號 R994 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）01-0018-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.04

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To evaluate the in vitro and in vivo genotoxicity of emodin-8-O-β-D-glucoside （EG）， and to compare the difference of in vitro cell test and in vivo test of rats. METHODS： 2D and 3D hepatocyte models were established by in vitro two-dimensional （2D） and three-dimensional （3D） cell culture. After modeling， 2D and 3D hepatocyte were divided into blank control group （0.5% DMSO）， mitomycin C group （positive control， 0.1 ?g/mL）， EG low-dose， medium-dose and high-dose groups （10， 50， 200 ?g/mL）， respectively. The micronucleus ratio and tail DNA% of HepaRG cells were detected. SD rats were divided into blank control group （0.5% sodium carboxymethyl cellulose）， ethyl methanesulfonate group （positive control， 200? ?mg/kg）， EG low-dose， medium-dose and high-dose groups （100， 300， 1 000 mg/kg）， with 6 rats in each group. They were given medicine intragastrically for consecutive 15 d， once a day. 15 days later， the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes， the tail DNA% and tail distance of peripheral blood lymphocytes and hepatocytes were measured. RESULTS： In the in vitro 2D HepaRG hepatocyte model， compared with blank control group， the micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell were increased significantly in mitomycin C group （P<0.01）. There was no statistical significance in micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell among EG groups （P>0.05）. In 3D HepaRG cell model， compared with blank control group， micronucleus formation rate and tail DNA% of HepaRG cell were increased significantly in mitomycin C group （P<0.01 or P<0.001）， while tail DNA% of HepaRG cell was increased significantly in EG high-dose group （P<0.01）. In the in vivo test， compared with blank control group， the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes， the tail DNA% and tail distance of peripheral blood lymphocytes and hepatocytes were all increased significantly in ethyl methanesulfonate group （P<0.01）. Tail DNA% of peripheral blood lymphocytes was increased significantly in EG high-dose group （P<0.01）. There was no statistical significance in the micronucleus formation rate of bone marrow polychromatic erythrocytes and hepatocytes， the tail DNA% and tail distance of hepatocytes among EG groups （P>0.05）; with the increase of dose， there was an increasing trend. CONCLUSIONS： The results of this study suggest that in 2D cell model， EG not lead to chromosome breakage and DNA damage， but the long-term administration and repeated administration in vivo of 3D cell model show that EG has a certain risk of DNA damage， so the evaluation results of 3D HepaRG cell model are more similar to those of rats in vivo.

KEYWORDS? ?Emodin-8-O-β-D-glucoside; Genotoxicity; Two-dimensional culture; Three-dimensional culture; Rat; Micronucleus test

肝臟是人體最主要的代謝及解毒器官，藥源性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）已成為藥品監管機構關注的重點[1]。隨著近年來臨床不斷出現含蒽醌類成分的中藥致肝損傷的案例報道[2]，學界對蒽醌的肝損傷機制展開廣泛研究。目前已有體外研究數據提示，蒽醌類化合物存在遺傳毒性風險和致突變作用[3]。課題組前期研究中也證實大黃素可誘導正常人源肝細胞HepaRG染色體損傷和DNA斷裂，在體外彗星及微核試驗中呈陽性結果[4]。蒽醌類的潛在遺傳毒性，尤其是肝臟腫瘤發生風險有待深入探索。

大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（Emodin-8-O-β-D-glucoside，EG）是大黃素在體內的主要代謝產物及形式[5]，其原型同樣存在于大黃、何首烏、虎杖、決明子、冬凌草等中藥中且含量較高[6]。以何首烏為例，不同產地的何首烏藥材中EG的含量最高可達0.42%[7]。文獻報道EG可有效提高中樞神經系統中乙酰膽堿含量，保護神經元損傷，對阿爾茨海默病有一定改善，臨床應用較為廣泛。然而作為蒽醌類化合物，EG含有的羥基蒽醌結構屬于遺傳毒性警示結構，該結構與DNA堿基類似，使其可嵌入DNA鏈并導致沙門氏菌（尤其是TA1537菌株）回復性突變[8]。EG的遺傳毒性風險不容小覷，但目前關于EG的毒性及致癌性風險缺乏充足的試驗研究。

嚙齒類動物在毒性研究中獨具優勢，但是大量開展體內動物實驗成本較高且不符合替代毒理學減少動物使用的理念，因此，使用體外模型進行藥物毒性初篩及作用機制的初步研究十分必要。HepaRG細胞是從慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌患者體內非瘤組織分離而得的細胞株，能表現人肝細胞的大多數功能，其體外二維（Two-dimension，2D）培養模型是常用的體外肝毒性評價工具[9]。本課題組前期研究證實HepaRG細胞可在不額外添加代謝活化劑的情況下較好地代謝藥物，在了解以肝臟為靶器官遺傳毒性方面獨具優勢[10]。但2D模型缺乏細胞-細胞接觸和細胞-胞外基質間的聯系，長時間培養會出現生長抑制現象[11]。利用懸滴技術構建的三維（Three-dimension，3D）HepaRG多細胞聚球體模型則可長期培養，并能夠保持較高的白蛋白分泌水平和肝藥酶活性[12]，從而更好地模擬藥物體內代謝條件，提供更有價值的評價數據。

本研究同時利用體外2D、3D肝細胞培養模型和大鼠體內重復給藥試驗評價EG的遺傳毒性，并比較3種評價結果的差異，以期為EG的臨床合理應用和毒性評價方法的選擇提供參考。

1 材料

1.1 儀器

懸滴GravityPlusTM和GravityTRAPTM板（瑞士Insphero 公司）;VICTOR X5多功能酶標儀（英國Perkin Elmer 公司）;5180R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;NTS-1300恒溫振蕩水槽（東京理化器械株式會社）;DYCP-31F電泳儀（北京市六一儀器廠）;CX41三目生物顯微鏡（日本Olympus公司）;eclipse 80i熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;Komet 6.0 圖像分析系統（英國安道爾科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

EG（成都普菲德生物技術有限公司，批號：17110201，純度：98.0%）;甲磺酸乙酯（批號：141970611309162）、細胞松弛素B（批號：2989720）、二甲基亞砜（DMSO，批號：RNBG7476）均購自美國Sigma-Aldrich公司;磷酸鹽緩沖液（批號：AD19942268）、RPMI 1640培養基（批號：AE27856292）、Giemsa 染料（批號：SLBT6353）均購自美國Hyclone公司;胰蛋白酶消化液（批號：1974026）、胎牛血清（批號：1908121）均購自美國Gibco公司;絲裂霉素C（日本東京化成株式會社，批號：AKZ8O-EF）;羧甲基纖維素鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170830）;彗星分析試劑盒（美國Trevigen公司，批號：P191587）;Hanks平衡鹽溶液 （美國Corning公司，批號：28417007）; SYBR Gold 核酸凝膠染液（美國Invitrogen公司，批號：1987319）;吖啶橙（美國Fluka公司，批號：930226）。

1.3 細胞

HepaRG人源肝細胞系購自美國Thermo Fisher Scientific公司，本試驗所用細胞為第11～12代。

1.4 動物

SPF級SD大鼠30只，5～6周齡，均為♂。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。在恒溫（20～26 ℃）、恒濕（40%～70%）、各12 h明暗周期的條件下飼養。飼養密度為2～3只/籠。提供經鈷60放射滅菌的鼠全價顆粒飼料，自由攝食及飲水，取材前不禁食禁水。本研究方案通過國家藥物安全評價監測中心實驗動物福利倫理委員會（Institutional animal care and use committee，IACUC）審查。

2 方法與結果

2.1 給藥濃度確定

在96孔培養板中，每孔接種5 000個HepaRG細胞，孵育18～24 h后給藥。分別設置空白對照組（0.5% DMSO）和EG給藥組（給藥濃度分別為324、162、81、27、9、3 ?g/mL），于37 ℃，5%CO2的條件下孵育24 h后，即得2D HepaRG細胞模型，然后每孔加入等體積的三磷酸腺苷檢測試劑，輕輕晃動，室溫平衡10 min后，采用酶標儀檢測各孔的三磷酸腺苷發光強度，并計算細胞存活率（%）=（EG各給藥組發光強度/空白對照組發光強度）×100%，再根據濃度與存活率關系曲線計算EG 的IC50。結果，2D HepaRG細胞模型中EG的IC50為205.4 ?g/mL，因此，將后續體外2D HepaRG細胞模型評價試驗中的EG高濃度設置為200 ?g/mL，由于體外3D HepaRG細胞模型評價試驗中的給藥時間長，給藥濃度不應高于體外2D HepaRG細胞模型評價試驗，為保證EG在不同體外細胞模型中的可比性，本研究EG在2D、3D HepaRG細胞模型中給藥濃度保持一致。

2.2 統計學方法

微核試驗、堿性彗星試驗結果以平均值±標準差（x±s）的形式列出。彗星試驗結果采用單因素方差分析對組間數據進行檢驗;微核試驗結果采用Poisson分布法檢驗;P<0.05表示差異有統計學意義。數據圖與統計結果經GraphPad Prism 7軟件處理生成。

2.3 體外細胞試驗評價EG遺傳毒性

2.3.1 體外2D HepaRG細胞模型評價EG遺傳毒性

（1）微核試驗。調整HepaRG細胞濃度為5×105 mL-1，取6孔細胞培養板，每孔添加2 mL培養液/細胞混合液，置37 ℃、5%CO2孵箱培養18～24 h。細胞達對數生長期時，將其分為空白對照組（0.5%DMSO）、絲裂霉素C組（陽性對照，0.1 ?g/mL）及EG低、中、高劑量組（10、50、200 ?g/mL），處理24 h后更換含細胞松弛素B（2 ?g/mL）的培養基，繼續培養40 h。收獲細胞并加入0.075 mol/L的氯化鉀溶液2 mL，室溫低滲處理5 min;加入固定液（無水甲醇 ∶ 無水乙酸=3 ∶ 1，V/V）5 mL固定， 1 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復固定2次，每個樣品滴片制備2張標本并編號。固定后的玻片標本浸入5% Giemsa應用液中，染色25～30 min之后置于超純水中沖洗干凈，室溫下自然干燥。顯微鏡下觀察并計數每張玻片標本中每500個雙核細胞中含微核的細胞數，計算微核形成率，微核形成率=（含微核雙核細胞數/觀察雙核細胞總數）×100%[13]。

（2）堿性彗星試驗。HepaRG細胞處理及給藥方法同“2.3.1（1）”項下微核試驗，收獲細胞后調整細胞濃度為2×105 mL-1，將收獲的細胞進行制片、裂解、解旋、電泳、中和、脫水等處理后制成單細胞凝膠標本，每組制備3張標本。所有標本使用SYBR Green I（1 ∶ 10 000）染色，并在熒光顯微鏡下拍照（放大倍數200～400）。再使用Komet 6.0彗星圖像分析軟件進行分析，每個標本至少分析100個彗星細胞的尾DNA百分含量并計算中位數。

結果，與空白對照組比較，絲裂霉素C組HepaRG細胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高（P<0.01），且其微核形成率和尾DNA百分含量在文獻報道的范圍內[13]，也表明體外2D HepaRG細胞模型構建成功;EG各劑量組HepaRG細胞的微核形成率和尾DNA百分含量差異無統計學意義（P>0.05）。體外2D HepaRG細胞模型的微核形成率及尾DNA百分含量測定結果見圖1。

2.3.2 體外3D細胞模型評價EG遺傳毒性

參考盧賢歡等[8]的3D懸滴細胞模型培養方法構建體外3D HepaRG細胞模型，將HepaRG經2%DMSO高密度誘導培養14 d后，接種于GravityPlusTM板以懸滴法培養4 d;待形成肝細胞微球后加入培養液并將其轉移至Gravity TRAPTM板中;隔天換液，連續培養10 d，即得3D HepaRG細胞模型;然后分為空白對照組（0.5%DMSO）、絲裂霉素C組（陽性對照，6 ?g/mL）和EG低、中、高劑量組（10、50、200 ?g/mL），連續給藥3次，每次48 h，最后1次給藥時加入含細胞松弛素B（6 ?g/mL）的培養基。然后收集各組細胞，按“2.3.1”項下方法進行微核試驗與堿性彗星試驗。

結果，與空白對照組比較，絲裂霉素C組HepaRG細胞的微核形成率和尾DNA百分含量均顯著升高（P<0.01或P<0.001），EG高劑量組HepaRG細胞的尾DNA百分含量顯著升高（P<0.01），且隨著EG劑量的增加，3D HepaRG細胞的尾DNA百分含量升高，存在劑量效應相關性;EG各劑量在3D HepaRG細胞模型微核試驗結果雖為陰性，但微核形成率隨給藥劑量增加有升高趨勢。體外3D HepaRG細胞模型的微核形成率及尾DNA百分含量測定結果見圖2。

2.4 大鼠體內實驗評價EG遺傳毒性

2.4.1 大鼠分組及給藥

30只大鼠分為空白對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）、甲磺酸乙酯組（陽性對照，200 mg/kg，給藥劑量參考文獻[14]，給藥時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備灌胃溶液，甲磺酸乙酯為檢測體內DNA斷裂或染色體損傷時最常用陽性對照，故體內研究選擇甲磺酸乙酯作為陽性對照）和EG低、中、高劑量組（100、300、1 000 mg/kg，給藥劑量參考文獻[15]，給藥時用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備灌胃溶液），每組6只。連續灌胃給藥15 d，每天1次，給藥體積為15 mL/kg，末次給藥3 h后所有大鼠以CO2吸入法麻醉，從腹腔后大靜脈取血用于彗星試驗，采血量約0.5 mL/只。

2.4.2 微核試驗

（1）骨髓微核試驗。將大鼠處死后，取其單側股骨，剪斷兩端開放骨髓腔;吸取胎牛血清約1～2 mL，使用注射器針頭沖洗骨髓至試管中，并反復抽吸針頭數次吹打制成骨髓細胞懸液，經1 000 r/min離心5 min后，棄去大部分上清液，將骨髓細胞沉淀吹打均勻;吸取適量骨髓細胞懸液滴于潔凈玻片上推片，標本置于室溫下干燥，再經甲醇固定15 min后晾干待檢[14]。每只大鼠骨髓細胞樣本計數200個總紅細胞中的嗜多染紅細胞的數目，以及2 000個嗜多染紅細胞中含微核細胞的數目，分別計算嗜多染紅細胞占總紅細胞的百分率以及嗜多染紅細胞的微核形成率。

（2）肝臟微核試驗。取大鼠肝左葉約5 mm3大小組織，用刀片切成2～3 mm3小塊，加入含0.05%膠原酶的HBSS溶液，于37 ℃水浴中振搖孵育1 h，每30 min人工用力振搖1次，再用移液器反復吹打消化后的細胞懸液50次，再經40 μm細胞篩過濾后，加入3 mL固定液（無水甲醇 ∶ 冰醋酸=3 ∶ 1，V/V）固定，并以800 r/min離心1 min;棄上清，再次加入3 mL固定液并重懸，樣本于4 ℃條件保存待檢。鏡檢前，取10～20 μL細胞懸液，加入等體積的吖啶橙-DAPI溶液進行熒光染色;染色后，取10～20 μL混合液滴片后加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。每只大鼠的樣本計數1 000個含微核的肝細胞，計算肝細胞微核率。

結果，與空白對照組比較，甲磺酸乙酯組大鼠骨髓嗜多染紅細胞、肝細胞的微核形成率均顯著升高（P<0.01），EG各劑量組大鼠骨髓嗜多染紅細胞/總紅細胞比例和嗜多染紅細胞、肝細胞的微核形成率差異無統計學意義（P>0.05），但隨著EG劑量的增加，嗜多染紅細胞微核形成率及肝細胞微核形成率均有所增加，存在劑量效應相關性。各組大鼠骨髓嗜多染紅細胞/總紅細胞比例和嗜多染紅細胞、肝細胞微核形成率的測定結果見表1。

2.4.3 堿性彗星試驗

采集大鼠外周血約50 μL備用。肝組織樣本采集肝左葉約2～3 mm3大小組織置于3 mL切碎液（含20 mmol/L EDTA-2Na和10% DMSO的Hanks平衡溶液）中并使用剪刀剪碎組織以釋放細胞，經40 μm細胞篩過濾后置于冰上備用。取外周血淋巴細胞和肝細胞參考“2.3.1（2）”和“2.3.2”項下方法，分別進行體外2D、3D細胞模型的堿性彗星試驗，測尾DNA百分含量和尾距（尾距=尾DNA百分含量×頭部中心至尾部中心的距離）。結果，與空白對照組比較，甲磺酸乙酯組大鼠外周血淋巴細胞、肝細胞的尾DNA百分含量、尾距均顯著升高（P<0.01），EG高劑量組大鼠外周血淋巴細胞尾DNA百分含量顯著升高（P<0.01），EG各劑量組大鼠肝細胞的微核形成率和肝細胞尾DNA百分含量、尾距差異無統計學意義（P>0.05），由此可知，EG對外周血淋巴細胞的染色體或DNA損傷效應強于肝細胞。各組大鼠外周血淋巴細胞、肝細胞尾DNA 百分含量及尾距的測定結果見表2。

3 討論

遺傳毒性試驗通常平行設置陽性對照，確保試驗體系的可靠性。本研究根據文獻及經驗在體內及體外研究中選擇不同陽性對照，證實試驗體系成立、評價結果可信。絲裂霉素C為體外微核試驗常用陽性對照藥，可在非代謝活化條件下誘導微核試驗呈陽性結果[13]。鑒于當前針對體外彗星試驗，尤其是3D模型彗星試驗的文獻報道較少，且微核試驗所用陽性對照藥及濃度范圍通常可兼顧彗星試驗，故使用絲裂霉素C同時作為體外微核和彗星試驗的陽性對照藥[16]。甲磺酸乙酯是以體內染色體和DNA損傷為檢測終點時常用的陽性對照藥，同時也是體內彗星試驗聯合驗證的指定陽性對照[17]，故本研究將其作為體內微核和彗星試驗的陽性對照。

研究EG的致癌性風險對于臨床安全用藥具有重要指導意義。本研究首次同時利用體外2D、3D細胞模型及大鼠連續15 d體內重復給藥試驗評價EG的遺傳毒性風險。體內研究在傳統骨髓微核試驗的基礎上增加肝微核試驗，并平行取外周血及肝組織開展彗星試驗。肝微核試驗可同時考察毒性靶組織及藥物代謝產物的遺傳毒性，尤其在代謝產物體內遺傳毒性評價方面具有獨特優勢[18]。

本研究發現，在體外3D HepaRG細胞模型中，EG高劑量組HepaRG細胞的尾DNA百分含量與空白對照組相比顯著升高，且尾DNA百分含量與EG濃度存在明顯的劑量效應相關性;微核試驗結果雖為陰性，但可見類似趨勢。體內研究中，盡管EG在傳統骨髓嗜多染紅細胞微核試驗中呈陰性，但各劑量組微核形成率隨劑量升高有一定升高趨勢，且與肝微核試驗結果基本相符;此外，EG高劑量組可導致外周血淋巴細胞DNA明顯損傷，各劑量組之間呈劑量效應相關性，肝細胞彗星試驗結果為陰性但可見類似趨勢。2項研究中外周血淋巴細胞均較肝細胞更為敏感，可見EG可與外周血淋巴細胞DNA相互作用，存在一定遺傳毒性風險。相關體外和體內研究報道，含蒽醌環的化合物可導致遺傳物質斷裂、并導致微核試驗和彗星試驗結果呈陽性，如大黃素可誘導小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核形成率升高[19]，可導致體外培養人淋巴母細胞和肝細胞DNA斷裂[4，20]。大黃素和大黃酸可誘導哺乳動物細胞tk基因突變率增加[20]，蘆薈大黃素在排泄過程中可導致腎細胞和結腸細胞的DNA斷裂等[21]。分析原因認為與蒽醌結構可與Topo Ⅱ（Topoisomerase Ⅱ，Topo Ⅱ）的三磷酸腺苷結構域競爭結合并抑制Topo Ⅱ的活性，從而導致該復合物不易解離及DNA鏈斷裂 [19]。此外，也有研究顯示，蒽醌類化合物經Ⅰ相代謝后其遺傳毒性更強，如在體外試驗中添加大鼠肝微粒體酶S9后（S9混合物配方中僅含啟動Ⅰ相代謝反應的底物），其中蘆薈大黃素可誘導更多回復性菌落形成[15]。有研究根據大鼠灌胃EG后，在血漿、尿和糞便樣本中均可檢測到大黃素，推測EG在體內先水解為大黃素后再以游離蒽醌形式進一步在體內代謝[22]。因此，EG體內遺傳毒性物質基礎可能與分子量較小的含蒽醌母核的化合物有關，該結論有待經體內代謝及組織分布研究證實。

此外，本研究也發現，EG對體外2D HepaRG細胞模型無明顯致染色體斷裂及DNA損傷風險，而3D細胞模型對其具有明顯損傷，提示體外3D肝細胞模型的評價結果更接近于體內試驗。體外3D肝細胞模型現已被應用于藥物研發過程中的藥物評估[23-24]。體外3D肝細胞模型可長期培養，且能保持肝狀類似結構和組織代謝活動[25-26]，在重復給藥的體外肝毒性評價方面具有一定的優勢。本研究的結果也表明，體外3D肝細胞模型是良好的體外毒性評價方法，其評價結果與體內實驗相似，可以更準確地進行肝毒性藥物的早期篩選。

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（收稿日期：2019-07-01 修回日期：2019-09-16）

（編輯：唐曉蓮）