LC-MS/MS法測(cè)定抑郁癥患者晨尿中9種氨基酸類內(nèi)源性物質(zhì)的濃度

宋紅艷 夏敬勝 紀(jì)剛劍 任章燾 張相林 柳芳 陳靈

摘 要 目的：建立測(cè)定人體尿液中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、馬尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺、纈氨酸濃度的方法。方法：采集抑郁癥患者的晨尿，加入內(nèi)標(biāo)可的松，以乙腈處理后取上清液進(jìn)行濃縮，采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法（LC-MS/MS）進(jìn)行分析。色譜柱為XTerra RP18;流動(dòng)相A相為0.1%乙酸-水，流動(dòng)相B相為0.1%乙酸-乙腈（梯度洗脫）;柱溫為40 ℃;流速為0.45 mL/min;采用電噴霧離子源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）進(jìn)行定量分析，5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、馬尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺、纈氨酸和內(nèi)標(biāo)可的松在正離子模式下定量分析離子對(duì)分別為質(zhì)荷比（m/z）192.2→146.1、147.2→130.0、180.1→105.1、161.1→125.2、116.1→70.2、205.2→188.2、138.2→121.1、182.0→123.0、118.2→72.1、361.2→163.0。結(jié)果：5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍為10.00～3 200 ng/mL（r=0.993 8～0.998 9，n=6），定量下限為10 ng/mL;色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍為1 600～51 200 ng/mL（r=0.999 2～0.999 7，n=6），定量下限為1 600 ng/mL，準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果為86.29%～98.65%（n=6），日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)的RSD均不高于14.65%（n=6），基質(zhì)效應(yīng)的CV為6.18%～14.37%（n=6），提取回收率為86.21%～98.14%（n=6），穩(wěn)定性試驗(yàn)的RE均<14.71%（n=3～6）。結(jié)論：該方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于測(cè)定人體內(nèi)上述9種物質(zhì)的濃度。

關(guān)鍵詞 抑郁癥患者;尿液濃度;液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法;氨基酸類物質(zhì)

中圖分類號(hào) R969 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）01-0091-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.16

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the determination of 5-hydroxyindole acetic acid （5-HIAA）， glutamine， hippurate， pimelate， proline， tryptophan， tyramine， tyrosine and valine in human urine. METHODS： Morning urine samples were collected from depression patients. The sample was extracted with acetonitrile after addition of internal standard cortisone. LC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on XTerra RP18 column with mobile phase consisted of 0.1% acetic acid-water as mobile phase A and 0.1% acetic acid-acetonitrile as mobile phase B （gradient elution）. The column temperature was set at 40 ℃， and flow rate was 0.45 mL/min. Electrospray ion source （ESI） was used for quantitative analysis by multiple reaction monitoring （MRM）. The precursor/product ion transitions （m/z） were monitored at m/z 192.2→146.1， m/z 147.2→130.0， m/z 180.1→105.1， m/z 161.1→125.2， m/z 116.1→70.2， m/z 205.2→188.2， m/z 138.2→121.1， m/z 182.0→123.0， m/z 118.2→72.1 and m/z 361.2→163.0 （+ion-mode） for 5-HIAA， glutamine， hippurate， pimelate， proline， tryptophan， tyramine， tyrosine， valine and cortisone， respectively. RESULTS： The linear range of 5-HIAA， glutamine， pimelate， proline， tyramine and valine were 10.00-3 200 ng/mL （r=0.993 8-0.998 9， n=6）. The lower limit of quantification was 10 ng/mL; the linear range of hippurate， tryptophan and tyrosine were 1 600-51 200 ng/mL （r=0.999 2-0.999 7， n=6）. The lower limit of quantitation was 1 600 ng/mL. The results of accuracy tests were 86.29%-98.65% （n=6）. RSDs of intra-day and inter-day precision tests were no more than 14.65% （n=6）. CV of matrix effect were 6.18%-14.37% （n=6）. Extraction recovery rates were 86.21%-98.14% （n=6）. RE of stability tests were no more than 14.71% （n=3-6）. CONCLUSIONS： The method is sensitive， accurate and suitable for the determination of 9 substances in human.

KEYWORDS? ?Depression patients; Urine concentration; LC-MS/MS; Amino acid substances

抑郁癥神經(jīng)生物化學(xué)方面的研究是近幾十年來的研究的熱點(diǎn)，取得了很大的進(jìn)展，通過對(duì)抑郁癥臨床治療的有效藥物進(jìn)行研究，幾乎所有在臨床上有效的抗抑郁劑都能夠影響人體內(nèi)物質(zhì)含量的變化[1-2]。 目前臨床常用抗抑郁藥，如三環(huán)類抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制藥、5-羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑、 特異性的5-HT和去甲腎上腺素再攝取抑制劑（NERI）等，都圍繞增加5-HT、去甲腎上腺素（NE）等發(fā)揮抗抑郁作用。然而，現(xiàn)有的抗抑郁藥的治療率低、起效時(shí)間長(zhǎng)、復(fù)發(fā)率高等諸多不足引起了研究人員對(duì)抑郁癥和抗抑郁藥的重視。隨著代謝組學(xué)在抑郁癥研究中的廣泛應(yīng)用，抗抑郁藥的外周干預(yù)機(jī)制逐步凸顯。以γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）為代表的氨基酸類物質(zhì)與抑郁癥關(guān)系的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，抑郁模型小鼠體內(nèi)GABA增加是通過谷氨酸脫羧酶65和谷氨酸脫羧酶67兩個(gè)合成限速酶的增加引起的，從而進(jìn)一步引起小鼠行為和情感狀態(tài)的改變[3]。隨著研究的進(jìn)一步深入，許多研究者又提出抑郁癥與人體尿液中多種內(nèi)源性物質(zhì)相關(guān)，包括興奮性氨基酸物質(zhì)（例如谷氨酰胺），單胺類物質(zhì)代謝產(chǎn)物（例如5-羥基吲哚乙酸、色氨酸），NE和5-HT再攝取抑制劑（例如酪胺、酪氨酸）和其他氨基酸（例如脯氨酸、纈氨酸、庚二酸、馬尿酸）[4-5]。建立測(cè)定尿液中上述內(nèi)源性物質(zhì)含量的方法，對(duì)研究上述物質(zhì)與抑郁癥的關(guān)系具有重要意義。

朱曉偉、馬曉麗等[6-7]利用柱前或者柱后衍生法建立了測(cè)定氨基酸的含量測(cè)定方法;Filee R、Thianthum S等[8-9]將柱后茚三酮衍生聯(lián)用離子交換色譜法（Ion-exchange chromatography，IEC）廣泛地運(yùn)用于氨基酸的含量測(cè)定。雖然上述方法具有良好的分離度、線性范圍和重現(xiàn)性，但是，其分析時(shí)間較長(zhǎng)，尤其對(duì)于尿液樣本，方法的專屬性可能會(huì)因?yàn)榕c其余化合物潛在的相互作用而降低。此外，反相高效液相色譜（RP-HPLC）柱后鄰苯二甲醛衍生化用于測(cè)定氨基酸含量時(shí)雖然也分析時(shí)間較短及靈敏度較高，但是其樣品前處理方法較為復(fù)雜[10-12]。

本研究選擇將尿液樣品經(jīng)乙腈處理后，采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)（LC-MS/MS）法測(cè)定其中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、馬尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺、纈氨酸的濃度。由于生物內(nèi)源性的空白樣本較難獲取，本研究在方法學(xué)考察過程中，全部將健康人體尿液樣本中氨基酸類內(nèi)源性物質(zhì)的本底扣除。經(jīng)方法學(xué)考察，該方法專屬、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于臨床健康人體和抑郁癥患者尿液中上述9種內(nèi)源性物質(zhì)的含量測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀，包括G1322A在線脫氣機(jī)、G1312B泵、G1316B柱溫箱、G1367C自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）;API 5500四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子化源（ESI）（美國(guó)AB公司）。

1.2 藥品與試劑

5-羥基吲哚乙酸對(duì)照品（批號(hào)：TGECA-MI，純度：>98%）、馬尿酸對(duì)照品（批號(hào)：L4UOB-EC，純度：>98%）、庚二酸對(duì)照品（批號(hào)：FIMO1-QDIT，純度：>98%）、酪胺對(duì)照品（批號(hào)：LDVVF-AP，純度：>98%）、色氨酸對(duì)照品（批號(hào)：6XHKM-ON，純度：99%）均購自中國(guó)TCI試劑公司;脯氨酸對(duì)照品（批號(hào)：A02130623，純度：99%）、酪氨酸對(duì)照品（批號(hào)：A02131107，純度：98.5%）、纈氨酸對(duì)照品（批號(hào)：A02131208，純度：99%）均購自思域化工科技有限公司;谷氨酰胺對(duì)照品（阿拉丁試劑公司，批號(hào)：J1318016，純度：99%）;可的松（內(nèi)標(biāo)，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：101128-201001，純度：97.2%）;甲醇、乙腈（美國(guó)Tedia公司，色譜純）;水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 尿液樣本

本研究選取抑郁癥患者和健康受試者各6例，分別采集其晨尿。所有抑郁癥患者均符合以下條件：（1）符合《中國(guó)精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》第3版（CCMD-3）中關(guān)于抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13];（2）漢密爾頓抑郁量表HDRS評(píng)分為17～≤28分;（3）年齡18～60歲;（4）排除腦器質(zhì)性疾病、嚴(yán)重軀體疾病、藥物濫用和藥物過敏者，以及青光眼、內(nèi)分泌疾病及嚴(yán)重自殺企圖者;（5）既往無藥物服用史。所有健康受試者（18～60歲）和抑郁癥患者的心電圖、胸片檢查、血生化、血常規(guī)、尿常規(guī)及免疫學(xué)檢查結(jié)果均正常。本研究方案已經(jīng)通過武漢市第三醫(yī)院倫理委員會(huì)的論證，受試者均簽署書面知情同意書。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜柱：XTerra RP18（100 mm×3.91 mm，3.5 ?m）;流動(dòng)相A：0.1%乙酸-水，流動(dòng)相B：0.1%乙酸-乙腈，梯度條件：0～1 min 99%A，1～9 min 99%→68%A，9～11 min，68%→1%A，11～14 min 1%A;流速：0.45 mL/min;進(jìn)樣量：5 μL;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣器溫度：4 ℃。

采用電噴霧離子源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）正離子模式進(jìn)行定量分析，源噴射電壓：5.5 kV，霧化溫度：500 ℃，霧化氣（N2）壓力：20 psi，輔助氣（N2）壓力：10 psi，氣簾氣（N2）壓力：20 psi。9種待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品貯備液 精密稱取5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、馬尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺、纈氨酸對(duì)照品適量，分別置于量瓶中，加2%甲酸-水 ∶ 甲醇 （90 ∶ 10，V/V）溶解并定容，制成質(zhì)量濃度均為1.000? ? mg/mL的對(duì)照品貯備液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取可的松對(duì)照品適量，置于量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為30.02 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 尿液樣品的處理

精密吸取尿液上清液200 μL，置于1.5 mL EP管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，渦旋30 s，再加入200 μL的乙腈，渦旋60 s，于4 ℃下6 000×g離心10 min，吸取上清液1.5 mL，置于EP管中，于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00? μL 10%甲醇水溶液溶解，于4 ℃下6 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取同一例臨床抑郁癥患者尿液6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，在該條件下，谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸、酪胺、酪氨酸、色氨酸、庚二酸、馬尿酸、5-羥基吲哚乙酸和內(nèi)標(biāo)可的松的保留時(shí)間依次為2.01、2.11、2.33、4.42、4.72、7.40、8.80、8.90、9.11、12.01 min，LC-MS/MS圖見圖2。

2.5 線性關(guān)系和定量下限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下一系列對(duì)照品貯備液，分別以健康受試者尿液上清液稀釋，制成下列質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合工作液，其中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為10.00、25.00、100.00、200.00、400.00、1 600、3 200 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200 ng/mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，記錄峰面積。另取已知含量的健康受試者尿液200 μL，加入200 μL乙腈，渦旋60 s，于4 ℃下6 000×g離心10 min，取上清液，于40 ℃下氮?dú)獯蹈桑儆?00? ? μL 10%甲醇水復(fù)溶，6 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，記錄內(nèi)源性峰面積。以加入對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），加入對(duì)照品后的峰面積減去內(nèi)源性峰面積之差與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。9種待測(cè)物的線性關(guān)系和定量下限結(jié)果見表2。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下一系列對(duì)照品貯備液，分別以健康受試者尿液稀釋，制成3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，每個(gè)濃度制備6份，其中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為2 000、10 000、50 000 ng/mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，以測(cè)定值/標(biāo)示值×100%計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，9種待測(cè)物的準(zhǔn)確度在86.29%～98.65%之間，均符合相關(guān)規(guī)定。準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下一系列對(duì)照品貯備液，以健康受試者尿液上清液稀釋，制成3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，其中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為2 000、10 000、50 000 ng/mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度樣品日內(nèi)測(cè)定6份，連續(xù)測(cè)定6 d，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果顯示，9種待測(cè)物的日內(nèi)、日間RSD均不高于14.65%（n=6），均符合相關(guān)規(guī)定。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表4。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)考察

取流動(dòng)相200 μL，加入200 μL乙腈，渦旋60 s，于4 ℃下6 000×g離心10 min，取上清液，分別加入3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液100 μL（5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為2 000、10 000、50 000 ng/mL）和內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，每個(gè)濃度制備6份，吸取上清液于1.5 mL EP管中，于40 ℃下氮?dú)獯蹈桑儆?00 μL 10%甲醇水復(fù)溶，6 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，記錄峰面積A1。另取已知含量的健康受試者尿液上清液200 μL，按上述方法操作記錄峰面積A2。再取已知含量的健康受試者尿液200 μL，加入200 μL乙腈，渦旋60 s，于4 ℃下6 000×g離心10 min，取上清液，于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，再?00 μL 10%甲醇水復(fù)溶，6 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，記錄峰面積A3。以（A2-A3）/A1×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，9種待測(cè)物基質(zhì)效應(yīng)的CV均<15%，均符合相關(guān)規(guī)定，基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見表5。

2.9 提取回收率試驗(yàn)

取已知分析物含量的健康受試者尿液200 μL，分別加入3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液100 μL（5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為2 000、10 000、50 000 ng/mL）和內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，每個(gè)濃度制備6份，渦旋30 s，加入200 μL乙腈，渦旋60 s，于4 ℃ ，6 000×g離心10 min，取上清液于1.5 mL離心管中，于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，再?00 μL 10%甲醇水復(fù)溶，6 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析，記錄峰面積A4。再分別取已知含量的健康受試者尿液200 μL，按“2.8”項(xiàng)下方法操作，記錄峰面積A2和A3。以（A4-A3）/A2×100%計(jì)算提取回收率。結(jié)果顯示，9種待測(cè)物提取回收率為86.21%～98.14%，RSD為4.14%～14.29%，均符合相關(guān)規(guī)定，提取回收率試驗(yàn)結(jié)果見表6。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.10.1 室溫穩(wěn)定性 取同一份已知含量的健康人體尿液上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別制成3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，每個(gè)濃度制備3份，其中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為2 000、10 000、50 000 ng/mL，分別在室溫下放置0、3、6、9、12 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算測(cè)定值與標(biāo)示值的RE。結(jié)果顯示，9種待測(cè)物的RE均<14.71%（n=5），均符合相關(guān)規(guī)定。

2.10.2 處理后穩(wěn)定性 取同一份已知含量的健康人體尿液上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別制成3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，每個(gè)濃度制備3份，其中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為2 000、10 000、? 50 000 ng/mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，在室溫下放置0、3、6、9、12、24 h，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，計(jì)算測(cè)定值與標(biāo)示值的RE。結(jié)果顯示，9種待測(cè)物的RE均<14.21%（n=6），均符合相關(guān)規(guī)定。

2.10.3 凍融穩(wěn)定性 取同一份已知含量的健康人體尿液上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別制成3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，每個(gè)濃度制備3份，其中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為2 000、10 000、50 000 ng/mL，連續(xù)-20 ℃冷凍、室溫融化3次后，再按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算測(cè)定值與標(biāo)示值的RE。結(jié)果顯示，待測(cè)物的RE均<13.25%（n=3），均符合相關(guān)規(guī)定。

2.10.4 長(zhǎng)期穩(wěn)定性 取同一份已知含量的健康人體尿液上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別制成3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，每個(gè)濃度制備3份，其中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、纈氨酸、庚二酸、脯氨酸、酪胺的質(zhì)量濃度分別為20、1 000、2 500 ng/mL，色氨酸、酪氨酸、馬尿酸的質(zhì)量濃度分別為2 000、10 000、50 000 ng/mL，于-20 ℃下分別凍存1、15、30 d后，再按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算測(cè)定值與標(biāo)示值的RE。結(jié)果顯示，9種待測(cè)物的RE均<14.52%（n=3），均符合相關(guān)規(guī)定。

2.11 應(yīng)用

按本文方法分別測(cè)定6例抑郁癥患者晨尿中的5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、馬尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺和纈氨酸的含量，結(jié)果見表7。

3 討論

生物體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)由于濃度極低、干擾物質(zhì)多，一直是定量分析的難點(diǎn)。經(jīng)典的離子交換法和柱后衍生法也存在一些固有不足，如檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、前處理過程煩瑣、條件限制較多、干擾物質(zhì)多。LC-MS/MS法具有普適性好、分析時(shí)間短，且可以同時(shí)檢測(cè)多種內(nèi)源性物質(zhì)的特點(diǎn)，在內(nèi)源性物質(zhì)的體內(nèi)含量分析中發(fā)揮著重要的作用。然而，現(xiàn)有的測(cè)定內(nèi)源性物質(zhì)的LC-MS/MS法，通常需要使用昂貴的不含有內(nèi)源性物質(zhì)的特殊介質(zhì)或者忽略基質(zhì)效應(yīng)，直接采用對(duì)照品溶液進(jìn)行方法學(xué)考察。另一方面，由于儀器靈敏度限制，許多內(nèi)源性物質(zhì)的LC-MS/MS法樣品前處理方法煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高。

5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、馬尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺和纈氨酸是人體尿液中的內(nèi)源性物質(zhì)，含量低，與臨床多種疾病緊密相關(guān)。本文建立了LC-MS/MS法測(cè)定抑郁癥患者尿液中5-羥基吲哚乙酸、谷氨酰胺、馬尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪胺和纈氨酸的濃度，采用扣除內(nèi)源性物質(zhì)本底的方法進(jìn)行方法學(xué)考察，對(duì)于其他生物內(nèi)源性物質(zhì)的定量測(cè)定具有借鑒意義，同時(shí)該檢測(cè)方法樣本采用直接沉淀法，操作十分便捷。

綜上所述，本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、回收率高，可用于人體尿液中上述9種內(nèi)源性物質(zhì)的定量檢測(cè)。

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（收稿日期：2019-09-23 修回日期：2019-11-10）

（編輯：鄒麗娟）