LC-MS/MS法測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量

黃翠云 張鳳 柳珂 陳萬生 楊軍

摘 要 目的：建立測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇含量的方法。方法：采用液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）技術，以文多靈為內標，測定腫瘤患者給予紫杉醇后惡性腹水中紫杉醇的含量，色譜柱為Zorbax SB-C18，流動相為水溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L醋酸銨）-乙腈溶液（40 ∶ 60，V/V），流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為5 μL，離子源為電噴霧離子源，檢測模式為多重反應離子監測正離子模式，干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為10 L/min，毛細管電壓為4 000 V，紫杉醇和內標在正離子模式下質荷比（m/z）分別為876.5→308.0、457.3→188.1，碎片電壓分別為250、150 V，碰撞電壓分別為30、20 eV。結果：紫杉醇檢測質量濃度的線性范圍為25～2 500 ng/mL（r2=0.996 5，n=7）;定量下限為25 ng/mL;日內、日間精密度試驗的RSD為0.61%～3.62%（n=5、3）;準確度為95.34%～98.76%（n=5、3）;提取回收率的RSD為3.19%～3.72%（n=3）;基質效應的CV為1.52%～2.93%（n=3）;穩定性試驗的RE均小于3%（n=3）。結論：該方法簡便、準確，可用于測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量。

關鍵詞 液相色譜-質譜聯用;腫瘤患者;腹水;紫杉醇;含量測定

中圖分類號 R969 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）01-0086-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.01.15

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for content determination of paclitaxel in malignant ascites of tumor patients. METHODS： LC-MS/MS method was adopted. Using vindoline as internal standard， the content of paclitaxel in ascites of tumor patients was determined. The separation was performed on Zorbax SB-C18 column with mobile phase consisted of aqueous solution （containing 0.1% formic acid and 10 mmol/L ammonium acetate）-acetonitrile （40 ∶ 60， V/V） at the flow rate of 0.25 mL/min. the column temperature was 30 ℃， and sample size was 5 μL. The ion source was electrospray ion source， and the detection mode was multiple ion monitoring positive ion mode. MS parameters were set as following as dry gas temperature 350 ℃，dry gas flow rate 10 L/min，capillary voltage 4 000 V. Quantitative determination was operated in the multiple reaction monitoring （MRM） mode，with the ion transitions m/z 876.5→308.0 for paclitaxel and m/z 457.3→188.1 for the internal standard. The fragment voltage/collision energy for paclitaxel and the internal standard were 250 V/30 eV， and 150 V/20 eV，respectively. RESULTS： The linear range of paclitaxel were 25-2 500 ng/mL （r2=0.996 5， n=7）. The lowest limit of quantitation was 25 ng/mL. RSDs of inter-day and intra-day precision tests were 0.61%-3.62%（n=5， 3）. Accuracies were 95.34%-98.76%（n=5， 3）. RSDs of extraction recovery were 3.19%-3.72%（n=3）. CV of matrix effect were 1.52%-2.93%（n=3）. RE of stability tests were lower than 3% （n=3）. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate and suitable for the content determination of paclitaxel in malignant ascites of tumor patients.

KEYWORDS? ?LC-MS/MS; Tumor patient; Malignant ascites; Paclitaxel; Content determination

惡性腫瘤已經成為全球較大的公共衛生問題之一[1]。惡性腹水是由于惡性腫瘤病變引起腹腔臟壁層腹膜發生彌漫性病變而導致腹腔內液體異常增多的現象，是惡性腫瘤晚期常見的并發癥，在40%～60%的惡性腹水中能找到脫落的惡性腫瘤細胞[2]。紫杉醇是具有抗癌活性的二萜生物堿類化合物，在過去的幾十年里，紫杉醇廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的治療，以紫杉醇為基礎的聯合治療是上述惡性腫瘤晚期腹水的主要治療方案[3-4]。已有研究表明，全身化療聯合腹腔灌注化療方案對于全身多器官轉移的晚期胃癌患者，尤其是腹膜轉移胃癌患者，能夠使抗癌藥物在腹腔內維持較高的血藥濃度，從而抑制腫瘤細胞生長[5]。但目前尚未有相關研究開展紫杉醇惡性腹水濃度與療效之間的關系研究，而僅僅監測紫杉醇在血漿中的濃度不能準確反映其在惡性腹水中的濃度，因此，需建立穩定、可靠的檢測方法，監測紫杉醇在惡性腹水中的藥物濃度，為未來開展其濃度-療效相關性研究提供檢測技術。

目前已有多種分析方法對紫杉醇進行測定，例如反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定大鼠血漿中紫杉醇的濃度[6]、RP-HPLC法或液相色譜-質譜聯用法（LC-MS/MS）測定制劑中紫杉醇的含量[7-8]。但關于惡性腹水中紫杉醇含量的檢測方法目前研究較少。LC-MS/MS法是一種靈敏度高、特異性強的紫杉醇含量測定方法。因此，本課題組在前期研究[9]的基礎上，采用LC-MS/MS法，以文多靈為內標，建立了測定腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇含量的方法，以期為臨床監測相關患者惡性腹水中紫杉醇的有效濃度提供檢測技術。紫杉醇和文多靈化學結構圖見圖1。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC-G6410A型三重四級桿MS/MS儀，包括G1311A型四元泵、G1322A型真空脫氣機、G1329A型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、MassHunter軟件控制系統及數據處理工作站B.01.03（美國Agilent公司）;BSA124S-CW型天平、CPA225D型天平（德國Sartorius公司）;Mini spin型離心機（德國Eppendorf公司）;Labnet VX-200型定時可調速渦旋混合器（美國Labnet公司）;SK7200H型超聲儀（上?？茖С晝x器有限公司）;UNIVERSAL32R型臺式冷凍離心機（德國Hettich公司）。

1.2 藥品與試劑

紫杉醇對照品（批號：M1201AS，純度：98%）、文多靈對照品（批號：J1011AS，純度：98%）均購自大連美侖生物技術有限公司;甲醇（批號：10951907818，質譜級）、乙腈（批號：JA075930，質譜級）均購自德國默克公司;甲酸（批號：17033D，分析純）、乙酸銨（批號：H1709024，色譜純）均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司;水為屈臣氏純凈水。

1.3 樣品

空白腹水及含藥腹水均由上海長征醫院腫瘤科提供，分別為2例腫瘤患者未給藥和腹腔注射紫杉醇后6、8、12、24 h的腹水樣品，給藥劑量為20 mg/m2，所有患者都簽署知情同意書。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 貯備液的制備 分別精密稱取紫杉醇對照品2.01 mg、文多靈對照品2.00 mg，分別置于2 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成質量濃度為1 mg/mL的紫杉醇貯備液和內標貯備液，搖勻即得，于-20 ℃冰箱保存，備用。

2.1.2 工作液的制備 精密量取紫杉醇貯備液適量，以10%甲醇溶液稀釋，制備成質量濃度分別為0.25、0.625、1.25、2.5、6.25、12.5、25.0 μg/mL的標準工作液，以及質量濃度分別為0.625、2.5、12.5 μg/mL的質控工作液，現配現用。

2.1.3 標準曲線溶液與質控樣品溶液的制備 取“2.1.2”項下制備的7個水平的標準工作液和3個水平的質控工作液，分別用生理鹽水稀釋10倍，即得紫杉醇質量濃度分別為25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL的標準曲線溶液和質量濃度分別為62.5、250、1 250? ? ng/mL的質控樣品溶液。

2.2 腹水樣品的處理

取腹水樣品100 μL，加1 900 μL生理鹽水稀釋，渦旋30 s混勻;取稀釋樣品50 μL，置于1.5 mL的離心管中，加入含100 ng/mL內標的 0.1%甲酸甲醇溶液200? ? μL，渦旋混合3 min，19 751.6 ×g離心10 min，取上清液100 μL轉移至自動進樣小瓶，進樣檢測。

2.3 色譜條件與質譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）;流動相：水溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L 醋酸銨）-乙腈溶液（40 ∶ 60，V/V）;流速：0.25 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：5 μL。

采用電噴霧離子源（ESI），多重反應離子監測（MRM）正離子模式，毛細管電壓：4 000 V，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速：10 L/min，碰撞氣壓力：40 psi，流速：10 L/min，紫杉醇和文多靈的定量分析質荷比（m/z）分別為876.5→308.0、457.3→188.1，碎片電壓分別為250、150 V，碰撞電壓分別為30、20 eV。

2.4 專屬性考察

取空白腹水、空白腹水+紫杉醇對照品、含藥腹水（給藥后6 h），按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄圖譜。結果顯示，紫杉醇峰形良好，空白腹水中雜質不干擾紫杉醇和內標文多靈的檢測，專屬性符合相關要求。LC-MS/MS的總離子流圖見圖2。

2.5 標準曲線、線性范圍和定量下限

取“2.1.3”項下質量濃度分別為25、62.5、125、250、625、1 250、2 500 ng/mL的標準曲線溶液，按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，每一個濃度平行做5個樣品進行分析。以紫杉醇的質量濃度為橫坐標（x），紫杉醇與內標的峰面積比值為縱坐標 （y），進行加權線性回歸，權重系數為1/x2。得紫杉醇的回歸方程為y=0.001 8x-0.001 0（r2=0.996 5，n=7），線性質量濃度范圍為25～2 500 ng/mL，定量下限為25 ng/mL。

2.6 精密度與準確度試驗

取“2.1.3”項下質量濃度分別為62.5、250、1 250? ? ng/mL的質控樣品溶液，按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，每一個濃度平行做5個樣品進行分析，連續測定3 d。根據當天的標準曲線計算質控樣品溶液的實測質量濃度，考察日內、日間精密度的RSD，并以實測質量濃度/標示質量濃度×100%計算準確度。精密度與準確度試驗結果見表1。

2.7 提取回收率試驗

分別取“2.1.3”項下質量濃度為62.5、250、1 250 ng/mL的質控樣品溶液，各3份，按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積A;另取空白腹水，按“2.2”項下方法處理后，加入紫杉醇對照品溶液，制備成上述相應質量濃度的樣品溶液，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積B，以A/B×100%計算提取回收率。提取回收率試驗結果見表2。

2.8 基質效應考察

分別取“2.1.3”項下質量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質控樣品溶液，各3份，按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積A;另取“2.1.2”項下質量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質控工作液，各3份，按照“2.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積C，以A/C×100%計算基質效應?；|效應考察結果見表3。

2.9 穩定性試驗

分別取“2.1.3”項下質量濃度分別為62.5、250、1 250 ng/mL的質控樣品溶液，分別考察下列條件下的穩定性，每一個濃度平行做3個樣品進行分析?？疾鞐l件：（1）室溫條件下放置6 h，然后按“2.2”項下方法處理，再按照“2.3”項下條件進樣測定;（2）自動進樣室中放置24 h，再處理后進樣測定;（3）-20 ℃下冷凍，室溫融解，反復凍融3次，再處理后進樣測定;（4）-20 ℃下放置30 d，再處理后進樣測定。結果顯示，所有質控樣品均未出現降解、變質等變化，穩定性良好。穩定性試驗結果見表4。

2.10 腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的含量測定

取2例腫瘤患者腹腔注射紫杉醇后0、6、8、12、24 h的腹水樣品，紫杉醇的給藥劑量為20 mg/m2，將腹水樣品按“2.2”項下方法處理后，再按照“2.3”項下條件進樣測定，代入回歸方程計算惡性腹水中紫杉醇的含量。2例腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的藥-時曲線圖見圖3。

3 討論

3.1 LC-MS/MS條件的確定

筆者參考文獻[10-12]，在預實驗中分別考察了色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm，3.5? ? ? ?μm）、Agilent poroshell SB C18（75 mm×2.1 mm，2.7 μm）、Waters XBridge? BEH C18（50 mm×2.1mm，2.5 μm）時，對紫杉醇含量測定的影響，結果顯示，當色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18時，紫杉醇及內標的峰形最佳;流動相為乙腈/甲醇-甲酸水溶液、乙腈/甲醇-醋酸銨水溶液、乙腈/甲醇-甲酸與醋酸銨混合水溶液時，對紫杉醇含量測定的影響，結果顯示，紫杉醇在水溶液（含0.1%甲酸和10 mmol/L醋酸銨）-乙腈溶液（40 ∶ 60，V/V）等度洗脫的條件下響應、峰形均較好;柱溫為20、25、30 ℃時，對紫杉醇含量測定的影響，結果顯示，柱溫越高紫杉醇的出峰時間越早，且對峰形與峰面積無明顯影響，故為了節省分析時間選擇了柱溫為30 ℃;流速為0.25、0.3 mL/min時，對紫杉醇含量測定的影響，結果顯示，紫杉醇峰面積在0.3 mL/min流速下存在峰面積下降的情況，故選擇了流速為0.25 mL/min。

3.2 樣品的前處理

筆者在腹水處理過程中參考并借鑒了相關文獻中紫杉醇在血漿樣本中的處理方法[13-15]，結果顯示，相對于液-液萃取法，本實驗采用的蛋白沉淀法更加簡單快捷。其中，相比于乙腈，甲醇的沉淀效果更好，不易導致儀器系統壓力過高，并且在甲醇中加入少許甲酸可獲得較高的提取回收率，最終確定沉淀劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液。依據相關文獻[16-18]，選擇了多種沉淀劑比例V腹水 ∶ V沉淀劑（1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6），結果發現，當二者比例超過1 ∶ 4后，提取回收率均無明顯變化，故最終選擇沉淀劑與含0.1%甲酸的甲醇體積比為1 ∶ 4的方案。

3.3 內標的選擇

在內標選用時，筆者參考相關文獻[19]，選用了與紫杉醇物理化學性質相似的，且響應好、穩定的文多靈作為內標。

4 結語

綜上所述，本實驗通過對腹水樣品處理及色譜、質譜條件進行了良好的優化后，基于LC-MS/MS法建立了惡性腹水中紫杉醇的定量檢測方法。該方法的精密度和準確度良好，線性、穩定性、提取回收率及基質效應等符合2015年版《中國藥典》生物樣本檢測方法的要求，為未來腫瘤患者惡性腹水中紫杉醇的代謝研究、量效關系考察提供了研究基礎。

參考文獻

[ 1 ] 吳菲，林國楨，張晉昕.我國惡性腫瘤發病現狀及趨勢[J].中國腫瘤，2012，21（2）：81-85.

[ 2 ] 王懷碧，江飛龍，賴宗浪，等.惡性腹水的治療現狀及進展[J].中國中醫急癥，2017，26（12）：2162-2164.

[ 3 ] 陳國寧，蔡茂懷.紫杉醇、奧沙利鉑聯合欖香烯腹腔灌注治療胃癌晚期癌性腹水的臨床觀察[J].中國藥房，2016，27（36）：5095-5097.

[ 4 ] SCHIFF PB，FANT J，HORWITZ SB. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol[J]. Nature，1979，277（5698）：665-667.

[ 5 ] 郭增清，陳譽，陳玲，等.含紫杉醇兩藥方案聯合腹腔灌注化療治療合并腹腔種植轉移的晚期胃癌臨床觀察[J].徐州醫學院學報，2013，33（9）：592-597.

[ 6 ] 楊濤，崔福德，金大德. RP-HPLC法測定紫杉醇在大鼠血漿中的含量[J].沈陽藥科大學學報，2008，25（1）：48-51.

[ 7 ] FURMAN C，CARPENTIER R，BARCZYK A，et al. Development and validation of a reversed-phase HPLC method for the quantification of paclitaxel in different PLGA nanocarriers[J]. Electrophoresis，2017，38（19）：2536- 2541.

[ 8 ] 王艷寶，趙楠，王洪亮，等. LC-MS/MS法分析和鑒定抗腫瘤藥MTC-220原料藥中的雜質[J].中國藥房，2012，23（37）：3510-3514.

[ 9 ] GAO S，ZHOU J，ZHANG F，et al. Rapid and sensitive liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry method for the analysis of paclitaxel，docetaxel，vinblastine，and vinorelbine in human plasma[J]. Therapeutic Drug Monitoring，2014，36（3）：394-400.

[10] 錢雋，王漪璇，蘇圣民，等. LC-ESI-MS法測定人血漿中紫杉醇的濃度及其在藥代動力學中的應用[J].中國藥學（英文版），2012，21（4）：304-310.

[11] FERN?NDEZ-PERALBO MA，PRIEGO-CAPOTE F，LUQUE DE CASTRO MD，et al. LC-MS/MS quantitative analysis of paclitaxel and its major metabolites in serum，plasma and tissue from women with ovarian cancer after intraperitoneal chemotherapy[J]. J Pharm Biomed Anal， 2014.DOI：10.1016/j.jpba.2013.12.028.

[12] HENDRIKX JJ，ROSING H，SCHINKEL AH，et al. Combined quantification of paclitaxel，docetaxel and ritonavir in human feces and urine using LC-MS/MS[J]. Biomed Chromatogr，2014，28（2）：302-310.

[13] JIANG SG，ZU YG，ZHANG L，et al. Determination of a hydrophilic paclitaxel derivative，7-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel in rat plasma by LC-MS/MS[J]. Biomed Chromatogr，2009，23（5）：472-479.

[14] MORTIER KA，RENARD V，VERSTRAETE AG，et al. Development and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for the quantification of docetaxel and paclitaxel in human plasma and oral fluid[J]. Analytical Chemistry，2005，77（14）：4677-4683.

[15] KOBAYASHI M. Pharmacokinetic study of paclitaxel in malignant ascites from advanced gastric cancer patients[J]. World J Gastroenterol，2006，12（9）：1412-1415.

[16] LI D，ZHAO G，AI W，et al. Simultaneous LC-MS/MS bioanalysis of etoposide and paclitaxel in mouse tissues and plasma after oral administration of self-microemulsifying drug-delivery systems[J]. Biomed Chromatogr，2018，32（6）：e4192.

[17] MO J，EGGERS PK，RASTON CL，et al. Development and validation of a LC/TOF MS method for the determination of carboplatin and paclitaxel in nanovesicles[J]. Anal Bioanal Chem，2014，406（11）：2659-2667.

[18] 張鳴珊，劉國柱，李圣軍，等.溶劑誘導相變萃取法用于高效液相色譜-質譜分析的血漿樣品前處理[J].高等學校化學學報，2010，31（8）：1517-1521.

[19] MALHI S，STESCO N，ALRUSHAID S，et al. Simultaneous quantification of reparixin and paclitaxel in plasma and urine using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectroscopy （UPLC-MS/MS）：application to a preclinical pharmacokinetic study in rats[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2017.DOI：10.1016/j.jchromb.2016.12.015.

（收稿日期：2019-09-10 修回日期：2019-11-13）

（編輯：鄒麗娟）