基于miR-146a調控NF-κB信號通路探討芍藥甘草湯治療頸型頸椎病兔頸后肌炎癥損傷的作用機制

陳進城 林 榮 張圓芳 董繼泉 柳維林 江 征 陳少清 王薌斌 何 堅

1福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州350003；2福建省康復技術重點實驗室，福建 福州 350003；3福建中醫藥大學康復醫學院，福建 福州 350122；4湖州市南潯區人民醫院，浙江 湖州313000* 通信作者：何堅，E-mail：591003659@qq.com

頸型頸椎病是頸椎病的早期分型，伴隨著其他類型頸椎病的發展過程［1］，頸部疼痛是其最常見的癥狀［2］。成年人口中患病率為48.5%，長期使用電腦工作者的患病率為 55%［3-4］。IL-1β、IL-6、TNF-α 等作為促炎細胞因子在頸椎退變發展過程中起重要作用，NF-κB（nuclear factor-κB）信號通路已被證明可以調節IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子和趨化因子的轉錄，從而導致和加速頸椎的退變［5-6］。miR-146a通過其重要的靶基因TRAF-6發揮抗炎功能，通過抑制靶基因TRAF-6的水平和減少TLR4下游NF-κB的表達從而減少炎癥因子的水平［7］。芍藥甘草湯出自《傷寒論》。現代研究證明其具有抗炎、解痙之功效，被廣泛應用于臨床各種疾病［8-9］。本課題組前期研究已證實芍藥甘草湯對頸型頸椎病的疼痛和痙攣均具有顯著的療效［10］。為探究芍藥甘草湯對頸型頸椎病炎癥損傷的作用，本研究通過建立頸椎病兔模型，觀察芍藥甘草湯對兔頸后肌炎癥損傷的作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

選取6月齡SPF級新西蘭白兔（3.0～3.5 kg）38只，雌雄各半，由福建中醫藥大學實驗動物中心代購，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0011。

1.2 試劑及儀器

蘇木素伊紅染液（碧云天，美國）；IL-1β、IL-6、TNF-α（ELISA）試劑盒（上海西唐生物）；RT-qPCR試劑盒（艾德萊，北京）；兔子固定裝置（蘇州蘇杭科技器材有限公司）；酶標儀（Tecan，瑞士）；包埋機（Leica，德國）；電子顯微鏡（Leica，德國）；PCR 分析儀（Bio-Rad，美國）；Anti-NFκB Antibody，p65 subunit，active subunit，clone 12H11（Merck Millipore，美國）；Anti-MyD88 Antibody（aa263-273）（Isbio，美國）。

1.3 模型的建立與評估

1.3.1 兔頸型頸椎病模型的建立 參照張圓芳等［11］寒濕型兔頸型頸椎病模型進行造模。將兔子剃除頸部毛發后置于兔子固定裝置中，將其頸部前屈45°固定，于頸后放上平整的冰袋，冰袋兩端固定在裝置上，每次5 h，每天1次，連續干預8周后將動物置于室溫25～28℃中飼養，自由飲食、飲水。

1.3.2 兔頸型頸椎病模型的評估 造模后第2天，兔耳源靜脈采血，觀察兔血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平；觀察兔頸肌的僵硬程度。

1.4 實驗分組與給藥

1.4.1 分組 將38只6月齡的新西蘭白兔按照隨機數字表法分為正常組6只和造模組32只，造模后剔除不合格的和造模中死亡的兔子，再隨機分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組6只。

1.4.2 給藥 芍藥甘草湯方由白芍12 g、炙甘草12 g組成；所用藥材購自福建中醫藥大學承創堂河洛中醫館。按此量（24 g）為60 kg成人每日臨床用藥有效量計算，按人與兔體質量系數折算公式進行換算：

給兔子服用高、中、低劑量的芍藥甘草湯分別是成人用藥等效劑量的2、1、0.5倍，故根據公式算得高劑量組、中劑量組、低劑量組兔子每千克體質量用藥量分別為16、8、4 g／kg。每周對兔子測量體質量1次，根據兔子的具體體質量和每兔日服藥量公式計算出每只兔子每天所需藥材量，進而計算出每組兔子的日需藥材量。將藥材用自動煎藥機常規煎法，再用小火濃縮，每劑中藥均濃縮煎至160 mL，每次80 mL，每日2次；正常組和模型組予以等量的生理鹽水，連續給藥4周。

1.5 取材及樣本處理

1.5.1 血清標本的采集 分別于造模前1天上午、造模結束后第2天上午和芍藥甘草湯干預結束后第2天上午，對5組兔子均進行耳緣靜脈采血，并收集于標記好的采血管中，及時于4℃，轉速3000 r／min，進行離心，離心30 min后吸取血清上清液，-80℃冰箱保存。

1.5.2 頸后肌組織標本的采集 采用空氣栓塞法處死動物，后迅速取出頸后肌組織，一般取C3-6棘突旁約2 cm處的肌肉部分約1 cm3。將取下的組織分2個部分，一部分投入裝有4%多聚甲醛的EP管中固定，用作HE染色；另一部分置于EP管中，封蓋，-80℃冰箱保存，用作RT-qPCR檢測。

1.6 ELISA法檢測血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平

5組血清按ELISA的說明書進行操作；酶標儀吸收450 nm波長檢測A值。各孔檢測的A值減去空白組的A值為各孔實際A值，來反映血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

1.7 HE染色觀察兔頸頸后肌組織形態的變化

將取下的頸后肌組織放入4%多聚甲醛中固定48 h，后放入10%EDTA脫鈣，室溫脫鈣60 d。脫鈣完成后，進行石蠟包埋，制作石蠟切片，切片厚度為5 μm，常規脫蠟后，蘇木素染色5 min，自來水沖洗30 s，1%鹽酸分色3 s后，再用自來水沖洗30 s，PBS返藍30 min，再用蘇木素復染1 s。對每張切片依次進行常規逆梯度酒精脫水，最后用中性樹膠封片，常溫晾干，顯微鏡下觀察兔頸后肌組織形態的變化。

1.8 Western blot法檢測兔頸后肌組織蛋白的表達

收集頸后肌組織，將其在液氮中迅速研磨成細致粉末，研磨后加入蛋白裂解液按1 mg∶3 μL進行裂解，每20 min震蕩1次，2 h后取混合液至于1.5 mL離心管中4℃ 14 000 r／min離心 30 min，收集上清液，吸取上清液200 μL置于0.6 mL離心管中，加入50 μL蛋白上樣緩沖液；在95℃下變性5 min，根據BCA蛋白定量結果上樣，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠分離并轉移至PVDF膜，轉膜后用高效封閉液室溫封閉30 min。分別加入針對β-actin（1∶10 000）、NF-κB P65（1∶800）、MyD88（1∶1 500）的一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌緩沖液洗3次，每次10 min，加入二抗，在室溫下保持2 h，TBST洗滌緩沖液洗 3次，每次 10 min；使用 ImageQuant LAS 4000微型化學發光成像分析系統，并使用ImageJ軟件分析條帶密度，計算蛋白相對表達量。

1.9 RT-qPCR法檢測兔頸后肌組織中miR-146a、TLR4及TRAF-6的mRNA表達

從-80℃冰箱中取出兔頸后肌標本組織，液氮研磨成細粉后，各取75 mg粉末于1.5 mL EP管中，加入 1 mL Lysis／Binding buffer、200 μL 氯仿、無水乙醇等混勻攪拌，將混合液每次以700 μL加入至一個吸附柱RA中，多次離心后，取出吸附柱RA，提取總RNA。總RNA經處理后，根據逆轉錄試劑盒說明書將純化的RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行qPCR擴增。最后在熒光定量儀器中根據熒光定量試劑盒進行操作，設置的反應條件為：95℃30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s。

1.10 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計處理。計量資料服從正態分布均采用（±s）表示，選用單因素方差分析檢驗組間差異的顯著性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 模型評估

在整個造模操作過程中，兔頸后肌肉組織慢慢從柔軟變得痙攣、僵硬；造模結束后，兔頸后肌肉組織出現更明顯的條索狀肌痙攣癥狀，證明本次兔頸型頸椎病模型的成功建立。

造模結束后，除正常組在造模前后沒有明顯變化外，其他5組動物的相應血清炎癥因子表達水平均比造模前顯著升高，且造模4組與正常組相比，差異均有統計學意義（P＜0.01），而造模4組之間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），這也證明了本次兔頸型頸椎病模型的成功建立。見表1。

表1 干預前（造模后）5組血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression levels of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α in five groups before intervention （after modeling） （±s）pg／mL

表1 干預前（造模后）5組血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression levels of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α in five groups before intervention （after modeling） （±s）pg／mL

注：與正常組比較，1） P＜0.01。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.01.

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 6 I L-1 β 3.8 4±0.1 0 1 3.4 6±0.1 8 1）1 3.6 7±0.2 3 1）1 3.7 7±0.2 0 1）1 3.6 0±0.2 1 1）I L-6 2.6 9±0.1 3 9.0 2±0.1 4 1）8.8 8±0.1 7 1）8.8 0±0.2 7 1）8.8 3±0.2 5 1）T N F-α 4.5 5±0.0 8 9.4 1±0.4 0 1）9.3 4±0.3 4 1）9.3 0±0.3 9 1）9.3 6±0.3 1 1）

2.2 ELISA法檢測5組血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平

見表2。

表2 干預后5組血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α expression in five groups after intervention （±s）pg／mL

表2 干預后5組血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α expression in five groups after intervention （±s）pg／mL

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01；與低劑量組比較，3） P＜0.01；與中劑量組比較，4） P＜0.01。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.01;Compared with the model group,2)P＜0.01;Compared with the low dose group,3)P＜0.01;Compared with the middle dose group,4)P＜0.01.

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 6 I L-1 β 3.8 4±0.0 9 1 4.7 5±0.5 9 1）1 1.3 8±0.4 5 2）7.2 1±0.4 5 2）3）4.8 4±0.3 8 2）3）4）I L-6 2.6 9±0.1 3 9.2 7±0.3 0 1）6.6 0±0.3 3 2）5.3 7±0.2 9 2）3）3.3 0±0.2 6 2）3）4）T N F-α 4.5 5±0.0 8 9.6 9±0.2 3 1）8.1 7±0.3 1 2）6.5 9±0.3 0 2）3）5.2 2±0.1 6 2）3）4）

2.3 HE染色觀察5組頸后肌形態的變化

正常組肌細胞核橢圓形，頸肌纖維排列有序；模型組肌細胞變形，肌纖維斷裂，斷裂處出現大量炎癥細胞；低劑量組細胞核數量較模型組增多；中劑量組細胞核增加更明顯，肌纖維斷裂減少；高劑量組細胞核較多，炎癥細胞比中劑量組的更少。見圖1。

圖1 5組頸后肌形態變化（×400）Figure 1 Morphological changes of the posterior cervical muscle in five groups （×400）

2.4 Western blot法檢測兔頸后肌組織蛋白的表達

見表3和圖2。

表3 干預后 5組頸后肌組織中 MyD88、NF-κB P65 蛋白表達（±s）Table 3 Protein expression of MyD88 and NF-κB P65 in posterior cervical muscles in five groups after intervention （±s）

表3 干預后 5組頸后肌組織中 MyD88、NF-κB P65 蛋白表達（±s）Table 3 Protein expression of MyD88 and NF-κB P65 in posterior cervical muscles in five groups after intervention （±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.01。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.01;Compared with the model group,2)P＜0.05;Compared with the low dose group,3)P＜0.05;Compared with the middle dose group,4)P＜0.01.

N F-κ B P 6 5 0.6 3±0.0 4 2.8 4±0.2 1 1）2.0 3±0.0 1 2）1.3 6±0.2 0 2）3）0.6 4±0.0 5 2）3）4）組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 6 M y D 8 8 0.3 5±0.0 6 3.2 5±0.3 3 1）2.4 0±0.3 0 2）1.4 4±0.1 1 2）3）0.3 8±0.0 6 2）3）4）

2.5 RT-qPCR法檢測兔頸后肌中miR-146a、TLR4及TRAF-6的mRNA表達

見表4。

3 討 論

頸型頸椎病屬于頸椎病的早期分型，主要有酸脹、疼痛等不適，少數可伴有上肢的感覺異常［12-13］。研究發現，當頸前屈時，頸椎所承受的壓力增大，容易使其損傷、退變［14］。 本研究參照張圓芳等［11］的方法建立兔頸型頸椎病模型，操作簡便，成功率高，與臨床實際基本相符。研究發現長期低頭姿勢能夠引起兔頸椎炎癥損傷的產生，而炎癥反應是引起頸椎退變的重要原因之一［15］。IL-1β被認為是最重要的細胞因子，具有強烈的促炎活性，通過刺激產生多種促炎癥介質，如細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶［16-17］。此外，IL-1β 通過誘導細胞衰老凋亡促進氧化應激并加速細胞外基質的降解，從而加速頸椎退變［18］。TNF-α的水平與頸椎病患者的頸椎疼痛密切相關，TNF-α通過增加神經生長因子和血管內皮生長因子的產生，促進神經血管的生長，它還促進基質降解和增強物質p，這表明TNF-α可能與神經痛苦反應或促進結構中斷相關［19］。KISHIMOTO等［20］提出，IL-6是一種參與細胞增殖和分化、維持免疫穩態、巨噬細胞功能等關鍵功能的多功能細胞因子。經證實，IL-6作為促炎細胞因子，可導致繼發性損傷［21-22］。本研究對血清樣本進行了評估，發現與模型組相比，芍藥甘草湯干預組中血清炎癥因子比模型組明顯降低，這說明芍藥甘草湯能明顯降低兔血清中炎癥因子的表達，從而抑制炎癥反應。

圖2 干預后5組頸后肌組織中MyD88、NF-κB P65蛋白表達Figure 2 Protein expression of MyD88 and NF-κB P65 in posterior cervical muscles in five groups after intervention

NF-κB存在于不同類型的細胞中，是一個重要的轉錄調節因子，影響著細胞的生長、分化、凋亡等［23］。病毒、細菌、促炎性細胞因子等都會刺激NF-κB信號通路，引起NF-κB信號通路的激活，進而導致一系列相關疾病的發生。NF-κB信號通路對調控頸椎退變中的炎癥反應起到重要作用，在退變的頸后肌組織中，NF-κB信號通路被高表達的IL-6、IL-1β、TNF-α所調控，引起頸后肌細胞凋亡、蛋白聚糖降解，加劇了頸后肌的退行性病變［24］，當抑制NF-κB活性后，能有效降低炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α 的表達水平［25］。

表4 干預后5組頸后肌組織中miR-146a、TLR4、TRAF-6表達（±s）Table 4 Expression of miR-146a，TLR4 and TRAF-6 in posterior cervical muscle after intervention （±s）

表4 干預后5組頸后肌組織中miR-146a、TLR4、TRAF-6表達（±s）Table 4 Expression of miR-146a，TLR4 and TRAF-6 in posterior cervical muscle after intervention （±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.01。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.01;Compared with the model group,2)P＜0.05;Compared with the low dose group,3)P＜0.05;Compared with the middle dose group,4)P＜0.01.

T R A F-6 0.9 9±0.0 3 2 5.1 6±0.9 2 1）1 1.9 2±0.3 3 2）5.1 8±0.3 3 2）3）2.6 5±0.2 0 2）3）4）組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 6 m i R-1 4 6 a 1.0 0±0.0 3 0.0 4±0.0 1 1）0.2 0±0.0 2 2）0.4 7±0.0 2 2）3）0.9 9±0.0 5 2）3）4）T L R 4 1.0 0±0.0 7 1 4.3 0±0.5 0 1）9.2 1±0.3 5 2）5.8 3±0.2 8 2）3）2.0 8±0.2 6 2）3）4）

miRNA是一類小的非編碼RNA分子，可以作為許多途徑和生物過程（包括炎癥反應）的調節劑發揮關鍵作用。miR-146a作為協調免疫和炎癥信號傳導的最重要的miRNA之一，通常通過其公認的靶基因IL-1受體相關激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子（TNF）受體相關因子 6（TRAF6）發揮作用［7，26-27］，活化的IRAK1和TRAF6可引起NF-κB核位移，促進炎癥介質的釋放。研究發現，上調miR-146a細胞后可負性調節炎癥介質的釋放［7］。TLR4是一種膜結合蛋白，激活的TLR4可募集下游細胞內MyD88和TRIF蛋白，MyD88通過miR-146a的靶基因形成MyD88-IRAKs-TRAF-6復合體參加信號傳導，最終促進下游NF-κB通路的激活，釋放炎癥因子［28］。本實驗RT-qPCR法檢測顯示，干預后，高、中、低劑量組miR-146a的表達均升高，TLR4、TRAF-6的表達均降低，說明芍藥甘草湯可以提高兔頸后肌中miR-146a的表達，降低 TLR4和TRAF-6的表達，且高劑量效果最佳。

4 結 論

芍藥甘草湯減輕兔頸后肌的炎癥損傷，其作用機制可能是兔頸后肌組織中miR-146a通過抑制其重要的靶基因TRAF-6的水平減少TLR4下游NF-κB信號通路釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子。