改良Videman法復制兔膝骨關節炎的實驗研究

劉 晶 林巧璇 盧莉銘 郭澤興 劉 洪 張良志 修忠標

1福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004；2福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州350122；3中醫骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州350122；4福建省骨傷研究所，福建 福州350004* 通信作者：修忠標，E-mail：xzbdoctor@sina.com

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是指由多種因素引起的以進行性軟骨損害、軟骨下骨硬化、滑膜炎癥為表現的最常見慢性骨關節病，臨床以關節疼痛、腫大、僵硬伴關節功能障礙等為主［1］。KOA患病率高，全球約有2.5億人患有KOA，中國KOA患病率為8.1%［2］。目前，隨著全球人口老齡化進程加快，KOA發病率也呈上升趨勢，已成為全球第四大致殘性疾?。?］。由于KOA發病機制尚未完全清楚，該病的臨床癥狀經久難愈，反復發作。積極探索其發病機制，從而開發新治療技術和治療方法，對提高KOA的臨床療效具有重要作用。因此，制作穩定的、符合疾病發展規律的KOA理想動物模型是保證機制研究成功開展的關鍵環節。KOA模型制作最常用的動物為新西蘭大白兔，造模方法主要分為力學失衡法及化學藥物刺激法［4-6］。其中經典的Videman造模法通過伸直位固定建立膝KOA模型［7］，模擬了KOA發病過程中的軟組織慢性勞損，不受手術創傷及炎癥的影響，是開展實驗研究的相對理想模型［8］。然而，既往研究已表明Videman造模法在實踐過程中存在造模時石膏固定不牢靠、下肢缺血壞死發生率高，造模結束后石膏不易拆卸等不足［9-10］。本團隊在采用Videman造模法建立KOA兔模型用于針刀干預機制研究中，也發現了同樣的問題?；诖?，本團隊開展改良Videman造模法建立KOA模型制作的研究，通過行為學、影像學、軟骨形態學特征進行模型評價，并比較2種造模方法的石膏固定、石膏拆卸平均耗時及造模成功率，為建立穩定、可靠、有效的KOA兔模型提供科學方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

普通級健康雄性6月齡新西蘭白兔60只，體質量（2.0±0.5）kg，訂購于上海松聯實驗動物責任有限公司［生產許可證號碼：SCXK（滬）2017-0008］，委托福建省中醫藥研究院實驗動物中心［SYXK（閩）2016-0005］飼養。實驗動物單籠喂養，飼養房溫度20～25℃，濕度30%～60%，自然光照，自由進食、飲水。適應性飼養1周后，按隨機數字表法隨機分為正常組、傳統Videman法組（簡稱傳統組）和改良Videman法組（簡稱改良組），每組20只。本實驗已通過福建省中醫藥研究院動物實驗倫理委員會批準（FJATCM-IAEC2019037），實驗過程對動物的處置遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4%多聚甲醛、10%EDTA、0.9%NaCl注射液（南京丁貝生物有限公司）；光學顯微鏡、自動脫水機、組織包埋機、Leica2025石蠟切片（德國Leica公司）；黏附載玻片、蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；手術刀片（上海醫療器械批發部有限公司）；一次性包埋盒、包埋模具（上海源葉生物技術有限公司）；高分子石膏（陜西安信醫學技術開發有限公司）；普通石膏（浦江健宇衛生材料有限公司）；數顯關節角度尺（上海三量工具有限公司）；DR機（日本島津公司）；3.0T磁共振（德國西門子公司）。

1.3 造模方法

傳統組將兔左后肢膝關節用高分子石膏管型固定于伸直位［7］。改良組在傳統Videman造模法的基本原理上進行改良。具體方法：①將兔子仰臥于固定架上，助手面朝兔尾端坐下；先用2層脫脂棉包繞膝關節；然后右手握住實驗兔左后肢踝關節并牽拉，使膝關節處于伸直中立位0°位置；再用左手將石膏托（采用普通石膏制作，長約8 cm，寬約6 cm，厚度6～8層，提前塑型備用）放置在膝前側，石膏托的上1／4中心位于髕骨中點。② 操作者立于助手的右側，用高分子石膏繃帶單層螺旋纏繞大腿根部到趾尖上2 cm，然后塑型，保持膝關節伸直中立位0°，踝關節背曲60°。③ 最后使用防啃咬繃帶環形纏繞高分子石膏表面，防止兔啃咬石膏。見圖1。

1.4 指標檢測及方法

1.4.1 動物一般情況觀察 造模6周期間，定期觀察造模期間兔一般狀況，記錄兔石膏脫落、左后肢血運、會陰部感染及飲食等情況。

1.4.2 石膏固定、石膏拆卸平均耗時 記錄傳統組與改良組石膏固定操作時間、石膏拆卸時間，計算平均完成1只兔石膏固定及拆卸所需時間并進行比較。

1.4.3 Lequesne MG膝關節級別評分 造模結束后1 d，采用 Lequesne MG 評分［11］評估造模前后膝關節功能，包括疼痛刺激反應（0～3分）、步態改變（0～3分）、關節活動（0～3分）、關節腫脹（0～2分）。Lequesne MG膝關節評分總分反映膝關節功能障礙程度，總分越高，膝關節功能障礙影響越大。

1.4.4 影像學觀察 造模結束后1 d，采用腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉實驗兔行左膝關節X線、MRI檢測。X線檢測方法：拍正位片取仰臥位，屈髖 30°，伸膝 0°，髖外展 15°，保持髕骨位于正前方，放射球管距離膝關節110 mm；拍側位片取患側臥位，患側（左后肢）肢體伸直，健側（右后肢）肢體屈髖70°，屈膝45°，放射球管距離膝關節110 mm；檢測參數設置為照射電壓50 kV、照射電流250 mA、照射量32 mAs、照射時間128 ms。MRI檢測方法：取仰臥位，膝關節處于外翻位，固定角度為15°，掃描儀中心定位于髕骨下極處。掃描序列及參數包括：① T1-tse-cor（FOV：100 mm×100 mm，ST：2 mm，TR：831 ms，TE：11 ms）；② PD-tse-fs-tra（FOV：100mm×100 mm，ST：3 mm，TR：4 930 ms，TE：20 ms）；③ T2-tse-sag（FOV：100 mm×100 mm，ST：2 mm，TR：6 860 ms，TE：84 ms）；④ T2-de3d（FOV：130 mm×130 mm，ST：0.6 mm，TR：19 ms，TE：9 ms）。 觀察造模前后左膝關節間隙、關節腔積液、軟骨面光滑度等變化，磁共振膝關節骨關節炎的分級參考MOAKS評分［12］，包括① 關節軟骨缺損：0分為無，1分為＜10%，2分為10%～75%，3分為＞75%；② 滑膜炎：0分為正常，1分為輕度，2分為中度，3分為重度；③ 關節積液：0分為生理量，1分為少量，2分為中量，3分為大量；④ 骨贅：0分為無，1分為輕，2分為中，3分為重；⑤ 其他關節周征象，包括鵝足滑囊炎、髕下囊信號異常、髕前囊信號異常，1分為有，0分為無。MOAKS評分總分反映KOA損傷程度，總分越高，KOA程度越重。

1.4.5 形態學觀察 于造模結束后 1 d，麻醉下耳緣靜脈空氣栓塞處死，將實驗兔放置于冰面上，迅速解剖左側膝關節。行髕前正中切口，逐層分離軟組織至關節囊，用尖刀切斷股四頭肌在髕骨上緣附著處的肌腱，血管鉗提起髕骨上緣，沿髕骨兩側向下分離至脛骨平臺，切斷前后交叉韌帶側副韌帶，暴露股骨髁軟骨面和髕前滑膜，肉眼觀察關節軟骨、滑膜表面的形態、厚度以及色澤等大體的變化。軟骨肉眼觀評分參照PELLETIER等［13］的研究：關節軟骨表面光滑呈淡藍色或無色半透明狀，計0分；關節軟骨表面軟化但平滑，計1分；關節軟骨變薄，出現小纖維束狀變，計2分；關節軟骨明顯纖維束狀變，計3分；關節軟骨呈磨損性纖維束狀變，伴軟骨下骨外露及骨硬化，計4分。評分越高說明軟骨退變越嚴重。然后清除股骨遠端周邊肌肉及韌帶，用咬骨鉗取下股骨遠端。生理鹽水清洗、濾紙吸干后投入4%多聚甲醛中固定48 h。固定后用流水沖洗標本4 h，用10%EDTA對軟骨進行常規脫鈣處理。脫鈣完全后修切并進行常規石蠟包埋，以厚度5 μm進行組織石蠟切片制備，將組織切片置于60℃烘箱中干燥30 min后，放入二甲苯中脫蠟10 min；然后梯度乙醇溶液中入水各3 min；瀝干后浸入蘇木精液中染色10～20 min，蒸餾水沖洗；1%鹽酸酒精分色數秒，流水沖洗20 min至水清澈；PBS返藍，蒸餾水沖洗；入伊紅染料復染1 s，使細胞質染成紅色，中性樹膠封片，待封片劑凝固后拍照，圖像采集分析。每張片選擇3個視野，參照Mankin’s評分［14］進行分數統計。分級標準：正常0～2分，輕度病變3～7分，中度病變8～11分，重度病變12～14分。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料服從正態分布以（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，3組間采用單因素方差分析，方差齊用LSD-t檢驗，方差不齊用Tamhane’s T2檢驗；非正態分布采用秩和檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組兔造模期間一般情況比較

見表1。

表1 3組兔造模期間一般情況比較Table 1 Comparison of general situation in three groups of rabbits during modeling

2.2 3組兔左膝關節Lequesne MG評分比較

見表2。

表2 3組兔左膝關節Lequesne MG評分比較（±s） 分Table 2 Comparison of Lequesne MG scores of left knee joint in three groups （±s）Scores

表2 3組兔左膝關節Lequesne MG評分比較（±s） 分Table 2 Comparison of Lequesne MG scores of left knee joint in three groups （±s）Scores

注：與正常組比較，1） P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05.

L e q u e s n e M G評分0 7.5 0 0±1.3 1 4 1）7.5 5 6±1.1 4 9 1）組別正常組傳統組改良組n 2 0 1 2 1 8

2.3 3組X線和MRI影像學比較

見圖2和圖3。

圖2結果提示，造模結束后1天，與正常組相比，改良組與傳統組關節間隙均變窄（P＜0.05）；圖3結果提示，關節腔內積液增多、股骨髁軟骨面欠光滑，MOAKS評分顯著升高（P＜0.05）。改良組與傳統組影像學結果比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 3組左膝關節X線檢測關節間隙比較Figure 2 Comparison of X-ray images of left knee joint space in three groups of rabbits

2.4 3組組織形態學比較

見圖4和圖5。

圖4結果提示，與正常組相比，改良組與傳統組軟骨面無光澤，關節面變粗糙，部分有缺損，髕前滑膜增厚，色澤發黃，軟骨肉眼觀評分均升高（P＜0.05）。圖5結果提示，軟骨表層不平整，軟骨細胞排列欠規整，偶見軟骨細胞簇集，Mankin’s評分均升高（P＜0.05）。改良組與傳統組的形態學比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 石膏固定時間和拆卸時間比較

見表3。

3 討 論

理想的KOA動物模型能夠有效地模擬疾病發展過程。目前常用的KOA建模方法包括關節腔內注射藥物法，如注射木瓜蛋白造模法［5］；外科手術法，如 Hulth 法［6］；關節制動法，如 Videman 法［7］。其中Videman造模法制作的KOA模型無關節內影響和手術創傷，更接近病情自然發展過程。研究表明Videman造模法固定6周是制作KOA模型的理想方法［15-16］。但是實踐中發現，傳統Videman造模法易造成兔下肢缺血性壞死、石膏脫落、拆卸困難等不足，其他學者也遇到類似問題［9-10］。

圖3 3組兔左膝關節MRI檢測MOAKS評分比較Figure 3 Comparison of MRI images and MOAKS scores of left knee joint in three groups of rabbits

圖4 3組兔軟骨及滑膜肉眼觀評分比較Figure 4 Comparison of the macropathology scores of cartilage and synovium in three groups of rabbits

為解決上述問題，改良Videman造模法參考傳統Videman造模法的基本原理進行改良，具有以下3個特點。①膝前放置石膏托，有效防止石膏脫落：因為兔髕骨底離髖關節僅3～4 cm，只要管型石膏上緣脫離髕骨底上 1 cm左右，兔膝關節就可以彎曲活動，影響造模效果。傳統Videman造模法從髖部向下打石膏，用踝關節的彎曲角度（保持踝關節背曲60°）以阻止管型石膏滑落，但實際造模過程中石膏常常向下脫落導致造模失敗。分析原因考慮為兔因左后肢固定導致兔不適感而反復甩動導致脫落；另外在長期制動過程中，因為兔肌肉萎縮也可出現石膏脫落。而改良Videman造模法通過在膝前放置石膏托，起到良好固定作用，只要保證石膏托不滑離膝關節，就可以保證膝關節伸直位。②使用高分子石膏，減少下肢缺血壞死率：傳統Videman造模法使用普通石膏，成型較慢，塑型時間較久，需要疊加至一定厚度才具有固定效果，且其透氣性差，影響血液循環［9］。并且傳統Videman造模法為了防止石膏脫落，會加壓纏繞，尤其在踝關節處加壓，容易導致下肢缺血性壞死［10］。改良Videman造模法使用有機高分子石膏，成型快，塑型時間短，厚度薄且硬度高，耐磨損，只需要薄薄一層高分子石膏帶環形纏繞塑型即可確保石膏托不滑動，纏繞中也不需要加壓，從而降低下肢缺血壞死發生率。③石膏拆卸容易：傳統Videman造模法的管型石膏需要專門的切割工具進行拆卸，難度較大，耗時長，且容易損傷兔皮膚。改良Videman造模法僅薄薄一層高分子石膏，僅用普通鉗子即可完成拆卸，方便拆卸并大大縮短拆卸時間。

圖5 3組兔股骨髁軟骨HE染色光鏡觀察Mankin’s評分比較（×100）Figure 5 Comparison of Mankin's scores and HE staining observed by light microscope of femoral condyle cartilage in three groups of rabbits （×100）

表3 2組石膏固定及拆卸時間比較（±s）Table 3 Comparison of fixation and disassembly time of gypsum between two groups （±s）min

表3 2組石膏固定及拆卸時間比較（±s）Table 3 Comparison of fixation and disassembly time of gypsum between two groups （±s）min

注：與傳統組比較，1） P＜0.05。Note:Compared with the traditional group,1)P＜0.05.

石膏固定1 3.5 0 0±1.3 8 1 4.8 3 3±1.1 5 0組別傳統組改良組n 1 2 1 8石膏拆卸3 0.8 3 3±1.8 5 0 2.9 4 4±1.1 6 2 1）

本實驗結果表明：改良Videman造模法對比傳統Videman造模法，具有簡單舒適、拆裝便利、固定牢靠和造模成功率高的優點，同時能夠保證與傳統Videman造模法一致的造模質量，可作為研究KOA機制的理想造模方法。然而改良組也會出現了石膏滑落、會陰部感染死亡和下肢腫脹壞死脫落等情況。為了提高造模成功率，總結分析了改良Videman造模法過程中的經驗和教訓，以下幾點需要注意：①石膏托制作長度 6～8 cm，寬度5～6 cm，厚度 6～8層為宜，放置在以膝關節髕骨為中心，髕上2 cm到髕下6 cm位置。通過測量，髕底到髂前上棘的距離為3～4 cm，髕尖到踝關節中心的距離為9～10 cm，因此石膏托長度最長可達12～14 cm。但過長導致整體質量太大，限制兔髖部的活動，影響兔排尿，容易發生會陰部感染；過短容易滑落，需重打石膏，費時費力。因此本研究采取長度6～8 cm，取得良好的效果。石膏托需要保證與大腿皮膚一定的接觸面積才能穩定，測量兔子大腿平均周徑為10～12 cm，而太寬加重石膏質量，太窄容易滑動。本次研究采取石膏托寬度為大腿平均周徑的1／2，取得很好的效果。石膏托需要一定的硬度才能夠起到良好的支撐作用，太厚增加石膏重量，太薄石膏容易折斷。本次研究表明石膏托厚度在6～8層即具有良好的硬度，且不會過重影響兔髖部活動。石膏托宜放置在以膝關節髕骨為中心，髕上2cm到髕下6 cm位置，石膏托上緣太靠近髖關節，會影響髖部的活動，太靠近髕骨，容易出現滑落。本次實驗過程中改良組就出現1只兔因石膏托上緣太靠近髖關節，限制兔髖部的活動，影響兔排尿而發生會陰部感染。②纏繞高分子石膏切勿加壓，尤其是在石膏托下緣處。初期打石膏特別追求石膏的牢靠，刻意在纏繞高分子石膏條時加壓，尤其是擔心石膏托向下滑動，故在石膏托下緣處加壓纏繞，這樣極容易造成下肢缺血性壞死。本次實驗過程中改良組就出現1只兔因石膏托下緣纏繞高分子石膏條時過緊，影響下肢血液循環而出現下肢腫脹壞死。③高分子石膏條僅需纏繞1層即可。因為纏繞1層石膏條即可固定牢靠，不僅節約石膏費用，還透氣輕便，拆卸方便。

本實驗從兔左膝關節行為學、影像學、形態學角度揭示改良Videman造模法能夠達到與傳統Videman造模法一致的造模效果，通過對比固定與拆卸石膏操作耗時情況、造模過程中動物的死亡率，驗證了改良Videman造模法操作簡單、成功率高、死亡率低的優勢，為KOA機制研究奠定基礎。