長鏈非編碼RNARP11-385 J 1.2通過靶向微小RNA-370-3 p調控甲狀腺癌細胞增殖、侵襲及凋亡的作用機制

許玲玉，張豐姣，毛雨，羅方，康志強

鄭州大學附屬鄭州中心醫院內分泌科，鄭州450000

近年來甲狀腺癌在世界范圍內的發病率不斷上升，靶向治療可延長分化型和髓質性甲狀腺癌患者的無進展生存期[1]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）對甲狀腺癌具有重要的調節作用[2]。研究證實，lncRNA RP11-385J1.2（ENST00000421498）在甲狀腺乳頭狀癌[3]和非小細胞肺癌[4]中高表達，可能與非小細胞肺癌的發展有關。微小RNA（microRNA，miRNA）對甲狀腺癌的發生發展具有重要影響[5]。miRNA-370-3p在甲狀腺癌中表達下調，上調miRNA-370-3p的表達會抑制甲狀腺癌細胞的增殖和侵襲[6]。lncRNA RP11-385J1.2和miRNA-370-3p在甲狀腺癌中是否存在調控關系尚不清楚。本研究分析了lncRNA RP11-385J1.2對SW579細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并探討miRNA-370-3p在此機制中的作用，以期為甲狀腺癌的治療提供新的靶標，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺癌細胞株SW579、FTC-133、TPC-1、K1和正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1均購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640培養基、DMEM高糖培養基和L-15培養基均購自美國Gibco公司，牛血清白蛋白（bovine serun albumin，BSA）、噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和胰蛋白酶均購自美國Sigma-Aldrich公司，Transwell板購自美國Corning公司。引物、RP11-385J1.2干擾物（si-RP11-385J1.2）、miRNA-370-3p mimics（miRNA-370-3p）、miRNA-370-3p抑制劑（anti-miRNA-370-3p）、陰性對照（miRNA-con、anti-miRNA-con和si-con）、雙熒光素酶報告系統載體均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、Total RNA提取試劑盒、實時熒光聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒、反轉錄試劑盒均購自美國Invitrogen公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗體、Bax抗體和β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自英國Abcam公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega公司；流式細胞儀和細胞凋亡檢測試劑盒均購自美國BD公司；光學顯微鏡、全自動酶標儀及realtime PCR儀均購自美國Bio-Rad公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養將人甲狀腺癌細胞株SW579培養于L-15培養液中，將人甲狀腺癌細胞株FTC-133、TPC-1和K1培養于DMEM高糖培養液中，將正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1培養于RPMI-1640培養液中，培養液中均含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中常規培養。待細胞生長至對數生長期，洗滌、消化后傳代。

1.2.2 細胞轉染用培養液稀釋對數生長期的SW579細胞，然后以2×l05/孔接種于6孔板中，待細胞匯合度達到60%時，按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染。轉染分組：依據是否敲減RP11-385J1.2分為si-con組和si-RP11-385J1.2組；敲減RP11-385J1.2后依據是否抑制miRNA-370-3p分為si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-con組和si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-370-3p組；雙熒光素酶報告實驗中，依據RP11-385J1.2突變狀態及miRNA-370-3p轉染情況分為RP11-385J1.2（WT）+miRNA-con組、RP11-385J1.2（WT）+miRNA-370-3p組、RP11-385J1.2（MUT）+miRNA-con組、RP11-385J1.2（MUT）+miRNA-370-3p組；每組均設置相應的空白對照。先用無血清培養液稀釋脂質體、各組載體、片段或陰性對照，之后取等體積脂質體和載體及陰性對照輕柔混合，孵育20 min，加入到培養好的SW579細胞中，培養6 h，換成L-15完全培養基，轉染48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.2.3 Real-time PCR檢測RNA表達收集人甲狀腺癌細胞株SW579、FTC-133、TPC-1、K1和正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，根據Total RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板，按照real-time PCR試劑盒說明書合成miRNA-370-3p和lncRNA RP11-385J1.2，反應條件：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s、58℃ 40 s、72 ℃ 45 s，共35個循環；72 ℃ 10 min。采用 2-ΔΔCt法計算miRNA-370-3p和 RP11-385J1.2的表達水平。

1.2.4 MTT實驗檢測細胞增殖收集轉染后的各組SW579細胞，消化細胞并稀釋，以2×103/孔接種于96微孔板中，培養24、48、72 h時進行MTT實驗，每孔加入 20 μl MTT（5 mg/ml）溶液，培養 4 h，棄去培養液上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩5～10 min溶解結晶，采用酶標儀檢測490 nm處的光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲將-20℃的Matrigel置于4℃冰箱中融化過夜，取適量的4℃無血清培養基，按照1∶10的比例稀釋Matrigel，加入上層Transwell小室，37℃3 h烘干，將應用無血清培養基稀釋至2×105/ml的轉染后的各組SW579細胞以每孔100 μl加入小室的上層，下層培養孔中加入500 μl含10%FBS的L-15培養基，培養48 h，取出后應用冰甲醛固定細胞，結晶紫染色，顯微鏡計數侵襲細胞。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡收集轉染后的各組SW579細胞，以2×104/孔接種于6孔板中，培養48 h后棄去培養液，胰蛋白酶消化并收集細胞，按照膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（prop-idium iodide，PI）試劑盒說明書進行操作，加入200 μl binding buffer重懸細胞，再加入 5 μl Annexin VFITC和5 μl PI，混勻，室溫避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 蛋白質印記法（Western blot）檢測Bax、Bcl-2蛋白表達收集轉染后的各組SW579細胞，加入RIPA裂解液，室溫下裂解細胞20 min，冰浴超聲破碎細胞，收集蛋白并采用BCA法檢測蛋白濃度。每個樣本取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗（Bcl-2抗體1∶1000、Bax抗體1∶2500和β-actin抗體1∶2000），4℃孵育過夜，洗膜3次，然后加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育2 h。以β-actin為內參，計算Bax、Bcl-2蛋白的表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺癌細胞株和正常甲狀腺細胞中RP11-385 J 1.2和miRNA-370-3 p表達情況的比較

人甲狀腺癌細胞株SW579、FTC-133、TPC-1、K1和正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1中RP11-385J1.2和miRNA-370-3p的表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。人甲狀腺癌細胞株SW579、FTC-133、TPC-1、K1中RP11-385J1.2的表達水平均高于正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，miRNA-370-3p的表達水平均低于正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。RP11-385J1.2和miRNA-370-3p在4種甲狀腺癌細胞株中的表達情況一致，選擇SW579細胞進行后續實驗。

表1 不同甲狀腺細胞中RP11-385 J 1.2和miRNA-370-3 p表達情況的比較（±s）

表1 不同甲狀腺細胞中RP11-385 J 1.2和miRNA-370-3 p表達情況的比較（±s）

注：*與正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1比較，P＜0.05

細胞類型R P 1 1-3 8 5 J 1.2 m i R N A-3 7 0-3 p N t h y-o r i 3-1 1.0 0±0.1 2 1.0 0±0.1 8 S W 5 7 9 3.2 7±0.3 5*0.2 8±0.0 5*F T C-1 3 3 3.1 8±0.2 9*0.3 0±0.0 4*T P C-1 3.3 5±0.3 1*0.2 6±0.0 6*K 1 3.1 6±0.2 7*0.3 1±0.0 7*F值1 1 6.4 5 4 1 0 1.9 0 0 P值0.0 0 0 0.0 0 0

2.2 敲減RP11-385 J 1.2對SW579細胞增殖和侵襲的影響

NC組、si-con組、si-RP11-385J1.2組SW579細胞中RP11-385J1.2的表達水平分別為（1.00±0.13）、（0.98±0.12）、（0.36±0.06），差異有統計學意義（F=102.430，P＜0.01），其中si-RP11-385J1.2組細胞中RP11-385J1.2的表達水平低于NC組和si-con組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。NC組、si-con組、si-RP11-385J1.2組侵襲細胞數分別為（103.52±10.51）、（100.46±10.38）、（49.26±5.15）個，差異有統計學意義（F=102.511，P＜0.01），其中 si-RP11-385J1.2組侵襲細胞數低于NC組和si-con組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。NC組、si-con組、si-RP11-385J1.2組細胞培養24、48、72 h的OD值比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），其中si-RP11-385J1.2組細胞培養24、48、72 h的OD值均低于NC組和si-con組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2、圖1）

表2 不同組別SW579細胞增殖能力的比較（±s）

表2 不同組別SW579細胞增殖能力的比較（±s）

注：a與NC組比較，P＜0.05；b與si-con組比較，P＜0.05

組別OD值24 h48 h72 h NC組0.59±0.070.82±0.091.07±0.15 si-con組0.56±0.070.79±0.091.05±0.13 si-RP11-385J1.2組0.37±0.05a b0.53±0.07a b0.72±0.09a b F值31.24432.54521.960 P值0.0000.0000.000

圖1 不同組別SW579細胞的侵襲情況（結晶紫染色，×200）

2.3 敲減RP11-385 J 1.2對SW579細胞凋亡的影響

NC組、si-con組、si-RP11-385J1.2組細胞凋亡率、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。si-RP11-385J1.2組SW579細胞的凋亡率高于NC組和si-con組，Bax蛋白表達水平高于NC組和si-con組，Bcl-2蛋白表達水平低于NC組和si-con組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2、圖3、表3）

圖2 流式細胞術檢測不同組別SW579細胞的凋亡情況

2.4 RP11-385 J 1.2與miRNA-370-3 p的靶向關系

圖3 Western blot檢測不同組別SW579細胞中凋亡相關蛋白的表達情況

表3 不同組別SW579細胞的凋亡率及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達情況的比較（±s）

表3 不同組別SW579細胞的凋亡率及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達情況的比較（±s）

注：a與NC組比較，P＜0.05；b與si-con組比較，P＜0.05

組別N C組s i-c o n組s i-R P 1 1-3 8 5 J 1.2組F值P值凋亡率（%）4.2 1±0.4 3 4.4 3±0.5 1 1 9.1 8±1.5 4 a b 7 0 5.7 1 0 0.0 0 0 B a x蛋白1.0 0±0.1 2 1.0 4±0.1 5 3.0 2±0.3 4 a b 2 3 6.1 3 6 0.0 0 0 B c l-2蛋白1.0 0±0.1 6 0.9 6±0.1 3 0.3 2±0.0 4 a b 8 9.1 4 3 0.0 0 0

通過LncBase網站預測miRNA-370-3p與RP11-385J1.2存在結合位點（圖4）。RP11-385J1.2（WT）+miRNA-370-3p組細胞的熒光素酶活性為（0.36±0.05），低于 RP11-385J1.2（WT）+NC組的（1.00±0.13）和 RP11-385J1.2（WT）+miRNA-con組的（0.98±0.11），差異均有統計學意義（t=13.785、15.393，P＜0.05）。RP11-385J1.2（MUT）+NC組、RP11-385J1.2（MUT）+miRNA-con組、RP11-385J1.2（MUT）+miRNA-370-3p組細胞的熒光素酶活性分別為（1.03±0.15）、（1.01±0.16）、（0.99±0.13），3組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。si-RP11-385J1.2組細胞中miRNA-370-3p的表達水平為（2.96±0.34），高于 NC組的（1.00±0.18）和 si-con組的（1.02±0.13），差異均有統計學意義（t=15.284、15.989，P＜0.05）。（圖4）

圖4 RP11-385 J 1.2與miRNA-370-3 p的結合位點

2.5 下調miRNA-370-3 p表達可逆轉敲減RP11-385 J 1.2對SW579細胞增殖和侵襲的影響

si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-370-3p組SW579細胞中miRNA-370-3p的表達水平為（1.43±0.16），明顯低于si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-con組的（2.87±0.29），差異有統計學意義（t=12.953，P＜0.01）。si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-370-3p組的侵襲細胞數為（91.37±9.41）個，明顯多于si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-con組的（51.74±5.86）個，差異有統計學意義（t=10.725，P＜0.01）。si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-370-3p組細胞培養24、48、72 h的OD值均明顯高于si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-con組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表4）

2.6 RP11-385 J 1.2通過下調miRNA-370-3 p的表達抑制SW579細胞凋亡

si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-370-3p組細胞的凋亡率明顯低于si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-con組，Bax蛋白表達水平明顯低于si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-con組，Bcl-2蛋白表達水平明顯高于si-RP11-385J1.2+anti-miRNA-con組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表5、圖5）

表4 不同組別SW579細胞增殖能力的比較（±s）

表4 不同組別SW579細胞增殖能力的比較（±s）

組別s i-R P 1 1-3 8 5 J 1.2+a n t i-m i R N A-c o n組s i-R P 1 1-3 8 5 J 1.2+a n t i-m i R N A-3 7 0-3 p組t值P值O D值2 4 h 0.3 9±0.0 6 0.5 3±0.0 5 5.3 7 8 0.0 0 0 4 8 h 0.5 7±0.0 7 0.7 6±0.0 8 5.3 6 2 0.0 0 0 7 2 h 0.7 6±0.0 9 0.9 8±0.1 1 4.6 4 4 0.0 0 0

表5 不同組別SW579細胞的凋亡率及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達情況的比較（±s）

表5 不同組別SW579細胞的凋亡率及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達情況的比較（±s）

組別s i-R P 1 1-3 8 5 J 1.2+a n t i-m i R N A-c o n組s i-R P 1 1-3 8 5 J 1.2+a n t i-m i R N A-3 7 0-3 p組t值P值凋亡率（%）1 8.1 3±1.7 6 8.3 4±0.8 6 1 4.9 9 3 0.0 0 0 B a x蛋白2.8 9±0.2 9 1.4 7±0.1 6 1 2.8 6 2 0.0 0 0 B c l-2蛋白0.3 3±0.0 4 0.8 3±0.0 9 1 5.2 3 0 0.0 0 0

圖5 Western blot檢測不同組別SW579細胞中凋亡相關蛋白的表達情況

3 討論

甲狀腺癌是一種常見的內分泌惡性腫瘤，遺傳及表觀遺傳改變和積累是其發生和進展的主要原因，同時伴隨各種信號通路的失調，包括促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）、Wnt/β-聯蛋白（β-catenin）、缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）/促甲狀腺激素受體（thyrotropin receptor，TSHR）途徑等[7]。深入研究甲狀腺癌的發生和發展機制，發現新的靶點，對甲狀腺癌的治療具有重要意義。

研究表明，lncRNA RP11-385J1.2主要通過將表觀遺傳修飾物招募至其特異性位點調節染色質的狀態，其錯誤表達與多種惡性腫瘤有關[8]。RP11-385J1.2又稱ENST00000421498，其在宮頸癌中被研究，但未發現有顯著的差異表達[9]。有研究顯示，RP11-385J1.2在甲狀腺乳頭狀癌中高表達[3]。本研究結果表明，甲狀腺癌細胞SW579、FTC-133、TPC-1和K1中RP11-385J1.2的表達水平均高于正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1（P＜0.05），與既往研究結果[3]一致。本研究結果還顯示，敲減RP11-385J1.2可抑制SW579細胞增殖和侵襲并促進細胞凋亡，說明RP11-385J1.2在甲狀腺癌的發展中發揮重要作用。

miRNA-370-3p與多種惡性腫瘤有關，miRNA-370-3p在膠質母細胞瘤的治療中具有重要意義[10]，也是晚期胰腺導管腺癌的潛在腫瘤抑制因子[11]。在膀胱癌中，miRNA-370-3p通過抑制Wnt7a的表達抑制Wnt信號通路，進而抑制膀胱癌細胞的侵襲[12]。在卵巢癌中，過表達miRNA-370-3p可抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導的上皮-間充質轉化，發揮抑癌作用[13]。在甲狀腺癌中，上調miRNA-370-3p的表達可抑制腫瘤增殖和侵襲[6]。本研究發現，甲狀腺癌細胞SW579、FTC-133、TPC-1和K1中miRNA-370-3p的表達水平均低于正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1（P＜0.05），與相關研究結果[6]一致。

本研究通過LncBase網站預測miRNA-370-3p與RP11-385J1.2存在結合位點，因此假設RP11-385J1.2靶向miRNA-370-3p調控甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和凋亡。雙熒光素酶報告系統和realtime PCR結果顯示，RP11-385J1.2靶向負調控miRNA-370-3p的表達；在SW579細胞中同時抑制RP11-385J1.2和miRNA-370-3p的表達，結果發現，下調miRNA-370-3p可逆轉敲減RP11-385J1.2對SW579細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，證實了兩者在甲狀腺癌中存在調控關系。

綜上所述，lncRNA RP11-385J1.2通過靶向下調miRNA-370-3p的表達促進甲狀腺癌SW579細胞增殖和侵襲并抑制細胞凋亡，敲減RP11-385J1.2可上調miRNA-370-3p的表達，從而抑制甲狀腺癌的增殖和侵襲。lncRNA RP11-385J1.2和miRNA-370-3p是甲狀腺癌的潛在分子靶點，對甲狀腺癌的靶向治療具有重要意義。