微小RNA-146 a和血管內(nèi)皮生長因子在幽門螺桿菌相關(guān)性胃癌組織中的表達情況及臨床意義

許麗芳，任鴻昌，黃志君，閆虹#

中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心1門診部，2普外科，北京100101

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是革蘭氏陰性桿菌，存在于胃及十二指腸等部位[1]。Hp是引起胃炎、胃潰瘍、胃黏膜不典型增生等癌前病變的重要因素，在胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。幽門螺桿菌L型（Helicobacter pylori L type，Hp-L）是Hp在不利環(huán)境下形成的自我保護形式，可在機體長期存活，一旦感染，很難徹底清除。胃癌的發(fā)病率居全部惡性腫瘤的第4位，居中國惡性腫瘤發(fā)病率的第2位，近年來雖然醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，但胃癌的早期診斷率仍然不高，患者的5年生存率較低。微小RNA（microRNA，miRNA）-146a是目前醫(yī)學(xué)研究中的熱點之一，其在自身免疫性疾病、炎癥、惡性腫瘤等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[3]。研究顯示，miRNA-146a在不同腫瘤中發(fā)揮不同的作用，在骨髓惡性腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，在胰腺癌、宮頸癌中表達上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用[4]。研究報道，miRNA-146a在胃癌組織中表達下調(diào)，低水平的miRNA-146a與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且是患者總生存期的獨立預(yù)后因素[5]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促進內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成的重要因子，在腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用[6]。目前關(guān)于miRNA-146a與VEGF在Hp相關(guān)性胃癌中表達情況的研究較少。本研究通過分析miRNA-146a與VEGF在Hp相關(guān)性胃癌中的表達情況及臨床意義，旨在為胃癌的防治提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年3月至2018年9月于中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心接受治療的胃癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為胃癌；②術(shù)前未進行放療、化療等抗腫瘤治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他胃部疾病；②合并其他惡性腫瘤；③年齡＞75歲。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入112例胃癌患者。其中，男68例，女44例；年齡40～75歲，平均（58.45±9.71）歲。收集胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織（距胃癌組織邊緣5 cm以上）各112例。

1.2 試劑與儀器

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自美國Fermentas公司，鼠抗人單克隆抗體VEGF、Hp-L抗體均購自美國Santa Cruz公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒SuperScript Ⅲ購自北京博飛東方生物科技有限公司，Nano Drop分光光度計購自美國Thermo Fisher公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司，DYY-Ⅲ32型電泳儀購自北京六一儀器廠，定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀購自德國Biometra公司。

1.3 Hp-L檢測方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

對所有患者分別采用革蘭氏染色和免疫組織化學(xué)染色兩種方法檢測Hp-L的感染情況。Hp-L陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：革蘭氏染色和免疫組織化學(xué)染色均為陽性。革蘭氏染色：每例患者隨機觀察10個視野，Hp-L平均數(shù)≥20為陽性，革蘭氏染色多為紅色，少數(shù)為紫紅色。免疫組織化學(xué)染色：胃黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為Hp-L陽性。

1.4 qRT-PCR檢測miRNA-146 a和VEGFmRNA的相對表達量

剪切適量的胃癌組織和癌旁組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，應(yīng)用Nano Drop分光光度計測定RNA的濃度和純度，記錄光密度值（optical density，OD），OD260/OD280在 1.8～2.0之間表示RNA純度較好。采用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒SuperScriptⅢ將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行qRTPCR。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72℃2 min，共40個循環(huán)，72℃10 min。反應(yīng)體系（20 μl）：2×SYBR Mix 10 μl，上下游引物各 0.5 μl，10×cDNA 1 μl，ddH2O 8 μl。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miRNA-146a上游引物為5'-CAGTGTCGTGTCGTGGAGT-3'，下游引物為5'-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3'；U6上游引物為 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAT-3'，下游引物為 5'-CTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；VEGF上游引物為5'-CGCGTTCATGTCGTAATATTG-3'，下游引物為5'-TTCATCGTAAACACCAACGTG-3'；β-actin上游引物為5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3'，下游引物為5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'。其中U6和β-actin分別為miRNA-146a和VEGF的內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計 算miRNA-146a和VEGFmRNA的相對表達量。

1.5 免疫組織化學(xué)染色法檢測VEGF蛋白表達及判定標(biāo)準(zhǔn)

應(yīng)用4%福爾馬林溶液將胃癌組織及癌旁組織固定，石蠟包埋，切為4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化；3%H2O2孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗；滴加血清，37 ℃封閉30 min，加入VEGF一抗（1∶500稀釋）50 μl，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法染色，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下進行觀察。PBS代替一抗作為陰性對照。由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法進行閱片，光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個高倍視野進行觀察。陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色程度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比評分與染色程度評分相乘，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關(guān)分析法進行相關(guān)性分析；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miRNA-146a對Hp相關(guān)性胃癌的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp-L檢測結(jié)果

112例胃癌患者中Hp-L陽性101例，感染率達90.18%。

2.2 胃癌患者胃癌組織和癌旁組織中miRNA-146 a和VEGF mRNA表達情況的比較

Hp-L陽性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146a的相對表達量為（0.23±0.05），低于癌旁組織的（1.03±0.23），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=34.158，P＜0.05）；Hp-L陽性胃癌患者胃癌組織中VEGFmRNA的相對表達量為（3.45±0.12），高于癌旁組織的（1.02±0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=186.309，P＜0.05）。Hp-L陰性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146a的相對表達量為（0.56±0.06），低于癌旁組織的（1.04±0.25），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.192，P＜0.05）；Hp-L陰性胃癌患者胃癌組織中VEGFmRNA的相對表達量為（2.07±0.13），高于癌旁組織的（1.01±0.06），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.554，P＜0.05）。Hp-L陽性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146a的相對表達量低于Hp-L陰性胃癌患者胃癌組織（t=20.383，P＜0.05），VEGFmRNA的相對表達量高于Hp-L陰性胃癌患者胃癌組織（t=35.937，P＜0.05）。Hp-L陽性和陰性胃癌患者癌旁組織中miRNA-146a和VEGFmRNA的相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織和癌旁組織中VEGF蛋白表達情況的比較

Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中VEGF蛋白的陽性表達率為89.11%（90/101），明顯高于癌旁組織的24.75%（25/101），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=85.302，P＜0.01）。

2.4 不同臨床特征Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146 a和VEGF蛋白表達情況的比較

以miRNA-146a表達水平的中位數(shù)（0.72）為界，大于或等于此中位數(shù)為高表達，小于此中位數(shù)為低表達。不同年齡、腫瘤直徑、分化程度的Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146a的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146a的高表達率分別高于TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.251、5.342，P＜0.05）。不同年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中VEGF的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、高+中分化的Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中VEGF蛋白的陽性表達率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、低分化的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.349、6.079，P＜0.05）。（表1）

2.5 Hp相關(guān)性胃癌患者血清miRNA-146 a和VEGF mRNA表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Hp相關(guān)性胃癌患者血清miRNA-146a表達與VEGFmRNA表達呈負(fù)相關(guān)（r=-0.728，P＜0.01）。

2.6 miRNA-146 a對Hp相關(guān)性胃癌的診斷價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-146a診斷Hp相關(guān)性胃癌的臨界值為0.56，靈敏度為88.12%，特異度為92.08%，曲線下面積為0.949，P=0.005。（圖1）

表1 不同臨床特征Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146 a和VEGF蛋白的表達情況（n=101）

圖1 miRNA-146 a診斷Hp相關(guān)性胃癌的ROC曲線

3 討論

Hp是引起癌前病變的重要因素，目前Hp已經(jīng)被列為Ⅰ類致癌因素。研究顯示，Hp未感染者發(fā)生胃癌的危險性顯著低于Hp感染者，中國Hp感染率高達90%，若能減少Hp感染，則可以顯著降低胃癌的發(fā)生率[7]。Hp在膽汁、胃液、抗生素、氧濃度改變等環(huán)境下易發(fā)生細(xì)胞壁缺陷變異為Hp-L型。Hp-L對宿主的黏附性增加，且抗原性降低，其可逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，在機體內(nèi)引起慢性損傷。研究顯示，胃癌組織中Hp的檢出率顯著高于胃潰瘍組織，Hp-L可通過破壞DNA加速胃癌的進展，提示Hp長期存在與胃癌的發(fā)生有關(guān)[8]。本研究對112例胃癌患者進行Hp-L檢測，結(jié)果顯示，101例患者感染Hp-L，感染率達90.18%，提示Hp-L感染與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。

雖然近年來醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，但胃癌的早期診斷率仍然不高，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于進展期或晚期，因此需要尋找能夠早期診斷胃癌的腫瘤標(biāo)志物。miRNA作為一種非編碼小分子RNA，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞活動。近年來的研究報道m(xù)iRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。miRNA-146a位于人5q33染色體上，在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用[9]。研究報道，在NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中，miRNA-146a通過干擾細(xì)胞信號通路發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡的作用[10]。研究報道，敲除miRNA-146a后，小鼠患骨髓肉瘤和淋巴瘤的風(fēng)險增加，可能與miRNA-146a影響核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）通路有關(guān)[11]。高侵襲性乳腺癌細(xì)胞株中，過表達miRNA-146a可負(fù)調(diào)控NF-κB的激活，抑制下游基因白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、VEGF的表達，進而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力[12]。本研究結(jié)果顯示，Hp-L陽性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146a的相對表達量低于癌旁組織，Hp-L陽性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146a的相對表達量低于Hp-L陰性胃癌患者胃癌組織，且miRNA-146a低表達可能與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，提示miRNA-146a在Hp相關(guān)性胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，miRNA-146a低表達促進Hp相關(guān)性胃癌的發(fā)展。

靶基因預(yù)測軟件miRTarBase顯示，VEGF可能是miRNA-146a的靶基因。研究報道，VEGF參與多種病理生理過程，如細(xì)胞分化、凋亡、腫瘤血管生成等[13]。miRNA-146a可以抑制多種與炎癥相關(guān)的基因，包括IL-6、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8），過表達miRNA-146a可抑制視網(wǎng)膜組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表達。研究表明，在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞老化及老年性黃斑變性疾病中，miRNA-146a可以抑制VEGFA的表達，抑制新生血管生成[14]。研究表明，VEGF在肝癌組織和非小細(xì)胞肺癌組織中均高表達，且可以促進淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15-16]。腫瘤血管生成在腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，血管生成可以促進腫瘤轉(zhuǎn)移，上調(diào)VEGF的表達可以促進內(nèi)皮細(xì)胞分裂，促進血管生成，下調(diào)VEGF的表達可以抑制胃癌的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中VEGF蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁組織，Hp-L陽性胃癌患者胃癌組織中VEGFmRNA的相對表達量高于Hp-L陰性胃癌患者胃癌組織，VEGF蛋白陽性表達可能與TNM分期、分化程度有關(guān)，提示VEGF可以促進血管生成和胃癌的發(fā)展，與上述研究結(jié)果一致。研究表明，miRNA-146a通過下調(diào)肝癌細(xì)胞中VEGF的表達來抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。本研究結(jié)果顯示，Hp相關(guān)性胃癌患者血清miRNA-146a與VEGFmRNA表達呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），提示miRNA-146a在Hp相關(guān)性胃癌患者中可能通過抑制VEGF的表達，抑制腫瘤血管生成，進而降低腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miRNA-146a診斷Hp相關(guān)性胃癌的靈敏度為88.12%，特異度為92.08%，曲線下面積為0.949，提示其可作為臨床診斷Hp相關(guān)性胃癌的重要指標(biāo)。

綜上所述，Hp相關(guān)性胃癌患者胃癌組織中miRNA-146a低表達，VEGF高表達，miRNA-146a可作為臨床診斷Hp相關(guān)性胃癌的重要指標(biāo)。