hsa-miR-206過表達調節MAPK通路抑制卵巢癌細胞CAOV3生長及運動

徐 瑤，鄧曉楊, 張 勇,3，吳 雯，肖 琳，張小虎

卵巢癌是一類發病率較高的婦科惡性腫瘤，死亡率在婦科惡性腫瘤中居首[1]。調查[2]顯示，約65%的卵巢癌患者處于癌癥晚期，經手術及放化療后仍預后不良，5年生存率≤30%。此外，近年來卵巢癌患者趨于低齡，卵巢癌發病率逐年遞增[3]，因此尋找有效治療方法顯得十分迫切。微小型RNA miR-206在卵巢癌中發揮抑癌作用，可抑制癌細胞的生長和癌組織的轉移[4]。而miR-206在卵巢癌中的抑癌機制還有待進一步研究。因此，該文通過上調miR-206，對其在卵巢癌細胞CAOV3中的作用機制進行了深入探究，為miR-206靶向治療卵巢癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑卵巢癌細胞CAOV3購自美國典型培養物保藏中心；熒光素酶系統檢測試劑盒、反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒和Lipofectamine2000轉染試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；TRIzol及Opti-MEM均購自美國Invitrogen公司；miR-206 mimic和pc-MAPK1質粒由上海生工生物設計并合成；Brdu試劑盒購自瑞士Roche公司，Transwell小室購自美國Corning公司；促分裂原活化蛋白激酶1 (mitogen activated protein kinase 1，MAPK1)、上皮型鈣黏附蛋白(epithelial calcium adhesive protein，E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、cAMP反應元件結合蛋白(CAMP reactive element binding protein，CREB)、P-CREB、Ets樣轉錄因子-1(Ets-like transcription factor-1，Elk-1)、P-Elk-1、原癌基因(proto-oncogene，c-Myc)及P-c-Myc兔來源單克隆一抗抗體購自美國Abcam公司；實驗所用二抗均購自上海博士德生物公司；RPMI 1640培養液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、DAPI及BCA試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 細胞培養與分組轉染體積分數10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640，37℃、5% CO2培養。細胞傳代次日換液，融合率達到85%時，以1×104個/ml的濃度再次傳代。將細胞分為Control、miR-206 mimic、pc-MAPK1及miR-206 mimic+pc-MAPK1組，根據Lipofectamine 2000說明書將miR-206 mimic質粒、pc-MAPK1質粒分別或聯合轉染進入miR-206 mimic、pc-MAPK1及miR-206 mimic+pc-MAPK1組CAOV3細胞，Control組加入等量空載。轉染6 h后換液，用于后續研究。

1.3 qRT-PCR檢測miR-206及MAPK1 mRNA水平將經或未經miR-206轉染的CAOV3細胞及其移植瘤組織中加入TRIzol于通風櫥中裂解，參考Thermo Fisher總RNA提取試劑盒說明書進行抽提，將得到的總RNA進行定量分析，每組取等量RNA反轉錄為cDNA，利用實時定量PCR試劑盒配制PCR體系進行PCR擴增，得到閾值Δct，以對照組2ΔΔCt平均值為基準1，實驗組2ΔΔCt平均值與對照組2ΔΔCt平均值相比得到的2ΔΔCt為相對變化倍數。

1.4 Brdu檢測CAOV3細胞增殖1.2中各組細胞以1.5×105個/ml的濃度接種于6孔板中，培養24 h后，加入10 μmol/L Brdu孵育8 h，PBS洗去未結合Brdu，以含95%乙醇、5%冰乙酸的固定液固定細胞，洗滌后加入Brdu單抗(1 ∶1 000)4℃過夜，二抗(1 ∶200)室溫避光孵育1 h。洗滌后DAPI復染細胞核，熒光顯微鏡觀察并計數。

1.5 Transwell檢測CAOV3細胞侵襲Matrigel于4℃預先融化，取少量融化Matrigel到Transwell小室中預包被。接種1.2中各組細胞于上室中，用無血清培養液進行培養。24 h后，棉簽拭去濾膜上層未遷移細胞，HE染色液對遷移下層細胞進行染色并計數。

1.6 Western blot法檢測相關蛋白表達RIPA裂解液提取1.2中各組細胞總蛋白，BCA試劑盒進行定量并調平，取各組蛋白30 μg，質量分數為10% SDS-PAGE將其分離，半干轉膜法將其轉移到PVDF膜上，脫脂奶粉2 h室溫封閉，一抗(GAPDH：1 ∶1 000，MAPK1：1 ∶1 000，vimentin：1 ∶1 000，E-cadherin：1 ∶1 000，P-CREB：1 ∶1 000，CREB：1 ∶1 000，P-Elk-1：1 ∶1 000，Elk-1：1 ∶1 000， P-c-Myc：1 ∶500，c-Myc：1 ∶500)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆二抗(1 ∶2 000)37℃ 1 h，最后曝光顯色并以GAPDH為內參。

2 結果

2.1 hsa-miR-206與MAPK1靶向關系生物信息網站TargetScan預測hsa-miR-206與MAPK1之間存在潛在靶向關系。與Control組相比，miR-206 mimic組miR-206表達上調(t=4.86，P<0.001)。各組間MAPK1表達水平差異有統計學意義(F=338.125，P=0.003)；與Control組相比，miR-206 mimic組MAPK1表達下調(t=3.34，P=0.009)，pc-MAPK1組MAPK1表達上調(t=3.38，P=0.008)；與miR-206 mimic組比較，mimic+pc-MAPK1組MAPK1表達上調(t=3.35，P=0.009)。各組間熒光素酶活性差異有統計學意義(F=187.364，P=0.006)；轉染miR-206 mimic可降低MAPK1 wt的熒光素酶活性，而對兩者結合位點突變的MAPK1 mut沒有影響。見圖1。

2.2 miR-206 mimic及pc-MAPK1對CAOV3細胞增殖影響4組間熒光素酶活性差異有統計學意義(F=543.297，P=0.000)；與Control組BrdU陽性細胞百分比(68.12±9.23)%比較，miR-206 mimic組BrdU陽性細胞百分比(9.54±5.12)%下降(t=4.27，P=0.002)，pc-MAPK1組BrdU陽性細胞百分比(94.34±6.27)%上升(t=3.45，P=0.008)。與miR-206 mimic組BrdU陽性細胞百分比(9.54±5.12)% 比較，miR-206 mimic+pc-MAPK1組BrdU陽性細胞百分比(56.62±7.13)%上升(t=4.11，P=0.003)。見圖2。

2.3 miR-206 mimic及pc-MAPK1對CAOV3細胞侵襲影響4組間熒光素酶活性差異有統計學意義(F=621.377，P=0.000)；與Control組侵襲細胞數(55.12±9.23)比較，miR-206 mimic組侵襲細胞數(11.14±5.17)減少(t=3.43，P=0.008)，pc-MAPK1組侵襲細胞數(164.22±23.21)增多(t=3.52，P=0.007)。與miR-206 mimic組侵襲細胞數(11.14±5.17)比較，miR-206 mimic+pc-MAPK1組侵襲細胞數(45.32±9.11)增多(t=3.33，P=0.009)。見圖3。

2.4 miR-206 mimic及pc-MAPK1對CAOV3細胞上皮間充質轉化影響4組間E-cadherin表達量和vimentin表達差異均有統計學意義(F=623.764，P=0.000；F=889.463，P=0.000)。與Control組比較，miR-206 mimic組細胞中E-cadherin表達增加(t=4.13，P=0.003)、vimentin表達減少(t=3.51，P=0.007)，pc-MAPK1組E-cadherin表達減少(t=3.27，P=0.010)、vimentin表達增加(t=3.31，P=0.009)。與miR-206 mimic組比較，miR-206 mimic+pc-MAPK1組E-cadherin表達減少(t=4.02，P=0.003)，vimentin表達增加(t=3.36，P=0.009)。見圖4。

圖1 miR-206與MAPK1靶向關系

A：miR-206與MAPK1之間的連續結合片段；B：miR-206 mimic對miR-206影響；C：miR-206 mimic及pc-MAPK1對MAPK1影響；D：熒光素酶活性實驗檢測miR-206與MAPK1靶向關系；與Control組比較：**P<0.01；與miR-206 mimic組比較：##P<0.01；與MAPK1mut組比較：△△P<0.01

圖2 BrdU染色檢測各組CAOV3細胞增殖情況 BrdU×400

圖3 Transwell檢測各組CAOV3細胞侵襲情況 結晶紫×400

圖4 Western blot法檢測各組CAOV3細胞vimentin和E-cadherin蛋白表達

與Control組比較：**P<0.01，與 miR-206 mimic組比較：##P<0.01

2.5 miR-206 mimic及pc-MAPK1對CAOV3細胞MAPK信號通路的影響各組間P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1、P-c-Myc/c-Myc表達量比值差異有統計學意義(F=468.392，P=0.000；F=143.674，P=0.001；F=697.314，P=0.000)。與Control組比較，miR-206 mimic組細胞中P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值降低(t=3.27，P=0.010；t=3.26，P=0.010；t=3.28，P=0.010)，pc-MAPK1組P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值升高(t=3.31，P=0.009；t=3.29，P=0.010；t=3.34，P=0.009)。與miR-206 mimic組比較，miR-206 mimic+pc-MAPK1組P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值升高(t=3.27，P=0.010；t=3.28，P=0.010；t=3.29，P=0.010)。見圖5。

2.6 miR-206 mimic對CAOV3細胞裸鼠皮下移植瘤影響與Control組裸鼠皮下移植瘤體積(2134.26±199.33)mm3比較，miR-206 mimic組(496.21±187.13)mm3減小(t=6.51，P<0.001)。與Control組相比，miR-206 mimic組移植瘤組織中miR-206表達增加(t=4.65，P=0.001)，MAPK1 mRNA水平降低(t=3.86，P=0.004)，miR-206 mimic組VEGF表達及P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值降低(t=3.37，P=0.009；t=3.34，P=0.009；t=3.40，P=0.008)，Ki67及Vimentin陽性細胞百分比減少(t=4.45，P=0.002；t=4.22，P=0.002)。見圖6。

圖5 Western blot法檢測各組CAOV3細胞P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc水平

3 討論

miRNA是一類用于調節靶基因表達的小型單鏈非編碼RNA，在各種細胞增殖、分化、發育和凋亡過程中發揮著至關重要的作用。miR-206作為一類抗癌基因，在卵巢癌細胞中被下調，上調miR-206表達可抑制卵巢癌發生發展[5]。miR-206可調節多個基因表達，在乳腺癌中，miR-206可靶向下調煙酰胺磷酸核糖轉移酶、轉化生長因子及T-box錄因子[6]；在胃癌中，miR-206可降低c-Met、周期蛋白依賴性激酶4及MAPK1的表達水平[7]。本研究利用生物信息預測顯示，在CAOV3細胞中miR-206可靶向下調MAPK1表達。

圖6 miR-206 mimic對CAOV3細胞裸鼠皮下移植瘤的影響

A：CAOV3細胞移植瘤照片；B：Western blot法檢測VEGF、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc水平；C：qRT-PCR檢測miR-206及MAPK1 mRNA水平，1：Control組；2：miR-206 mimic組；D：免疫組化檢測Ki67和vimentin表達 ×200；與Control組比較：**P<0.01

過度增殖及侵襲遷移是癌細胞的生長特性，降低癌細胞增殖及侵襲能力可抑制癌組織生長轉移。研究[6]表明，miR-206可靶向下調多個促癌基因，抑制癌細胞增殖及侵襲。在腎細胞癌中，miR-206通過抑制細胞周期蛋白G相關激酶表達，降低癌細胞增殖及侵襲能力[8]；在卵巢癌中，miR-206抑制其靶蛋白細胞周期蛋白D1及D2表達，阻礙癌組織的生長轉移[5]。在本文中，在卵巢癌細胞CAOV3中，miR-206可通過靶向下調MAPK1抑制細胞的增殖及侵襲。

上皮間充質轉化是促進癌細胞侵襲遷移的重要因素之一，其在蛋白水平上主要表現為E-cadherin表達減少，Vimentin表達增加。細胞黏附蛋白E-cadherin定位于上皮細胞中，主要維持細胞極性及完整性，是細胞增殖和侵襲的抑制因子[9]。波形蛋白Vimentin是上皮間充質轉化過程中的關鍵蛋白，可作為上皮間充質轉化的經典標記物，在上皮間充質轉化過程中，細胞骨架組分由以角蛋白為主轉變為以波形蛋白為主[10]。本研究表明，miR-206可通過靶向下調MAPK1阻礙CAOV3細胞上皮間充質轉化。

MAPK1信號通路在癌癥形成過程中發揮重要作用，如，在子宮內膜癌中，MAPK1過度激活可促進癌細胞的增殖侵襲及遷移[11]。據報道[12]，在卵巢癌中，抑制MAPK1表達可提高癌細胞對鉑類化合物的敏感性。cAMP反應元件結合蛋白CREB、Ets樣轉錄因子Elk-1及原癌基因c-Myc均為MAPK1的下游蛋白，CREB是轉錄增強因子，主要定位于細胞核中，當其被MAPK1磷酸化激活后可促進MAPK1靶基因的轉錄[13]；Elk-1是促癌基因，可通過調節細胞外基質相關酶的轉錄在癌組織浸潤轉移和血管形成中發揮重要作用[14]；c-Myc具有的增殖效應，能使細胞具有無限增殖的能力，可促進多種癌癥發生發展[15]。實驗結果表明，miR-206可通過靶向下調MAPK1抑制MAPK1信號通路的激活。

綜上所述， miR-206過表達通過靶向下調MAPK1抑制MAPK1信號通路來抑制卵巢癌細胞CAOV3生長及運動，這為靶向治療卵巢癌提供新的靶點。但是具體分子機制還有待進一步研究。