消退素D1調節巨噬細胞自噬對實驗性結腸炎小鼠的影響

余沛君，方 晨，梅詠玉，楊 彬，劉曉昌，許建明，梅 俏

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是臨床常見的慢性消化道疾病，復發性高，其發生發展與炎癥免疫反應的失調密切相關[1]。研究[2]表明巨噬細胞參與IBD。相關分子模式經識別后，觸發NF-κB信號通路激活和炎癥體活化，促進炎癥因子合成[3]。炎癥反應產生的線粒體活性氧等物質通過細胞自噬清除，維持機體穩態[4]。自噬流的動態過程出現障礙，將導致自噬受限，加重炎癥發生發展過程。因此，自噬可能通過不同機制調控機體炎癥過程。消退素D1(resolvin D1，RvD1)是一種多不飽和脂肪酸衍生物，具有抗炎作用。Bento et al[5]、Liao et al[6]研究提示RvD1可以減輕機體炎癥反應，但RvD1影響結腸炎的作用機制尚不清楚。該研究通過RvD1對實驗性結腸炎小鼠自噬的影響，探究RvD1對結腸炎的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與動物

1.1.1實驗動物 C57BL/6雄性小鼠32只，體質量(20±2)g，由安徽省動物中心提供。標準環境飼養1周。

1.1.2主要藥品與試劑 葡聚糖硫酸鈉購自美國Sigma公司；RvD1購自美國Cayman公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素-1(interleukin 1，IL-1)、IL-6、IL-10等的ELISA試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司；MPO試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1抗體購自美國Abcam公司；抗誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β、IL-1β前體、溶酶體相關膜蛋白2 (lysosomal-associated membrane protein 2，Lamp2)抗體購自北京Bioss生物科技有限公司；抗β-actin抗體購自北京市中杉生物科技有限公司；DNA合成試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；熒光定量PCR試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1分組 將小鼠采用隨機分組法均分為正常對照組、RvD1對照組、模型對照組和RvD1給藥組。對正常對照組及RvD1對照組小鼠，讓其自由飲用等量蒸餾水處理；對模型對照組及RvD1給藥組小鼠，讓其自由飲用由實驗室制備的5% DSS溶液處理，搭建實驗性結腸炎模型[7]。RvD1溶于含3% DMSO的生理鹽水，濃度為50 μg/kg。實驗第2、4、6天，RvD1對照組和RvD1給藥組腹腔注射RvD1，正常對照組和模型對照組腹腔注射等體積含3% DMSO的生理鹽水。實驗7 d后處死小鼠，留取小鼠結腸組織待測，同時制備腹腔巨噬細胞。

1.2.2小鼠結腸炎嚴重程度評價 用疾病活動指數(disease activity index，DAI)進行實驗評分[8]，評價各組小鼠結腸炎嚴重程度。取小鼠結腸組織HE染色，光學顯微鏡下觀察，進行組織學損傷指數(histological index，HI)評分[9]。

1.2.3腹腔巨噬細胞分離提取和透射電鏡觀察 按文獻[10]方法，PBS溶液沖洗小鼠腹腔，灌洗液離心后在RPMI-1640完全培養基(含10% FBS和1%青-鏈霉素)中進行細胞培養。經PBS洗滌，收集的黏附細胞即為腹腔巨噬細胞。將腹腔巨噬細胞離心，固定，脫水，環氧丙烷處理，包埋，切片，于電鏡下觀察腹腔巨噬細胞內自噬體結構。

1.2.4ELISA法檢測各組結腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和細胞因子含量 結腸組織勻漿離心取上清液，檢測結腸組織中MPO、IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α含量。

1.2.5qPCR法檢測小鼠腹腔巨噬細胞中IL-1β、iNOS及自噬相關基因mRNA的表達 取小鼠腹腔巨噬細胞，提取總RNA，經DNA合成試劑盒輔助，促進RNA生物反轉錄為cDNA。經實時熒光定量PCR試劑盒開始PCR。該生化反應過程需要如下基本條件：95 ℃、2 min；95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，共計40個反應循環。根據實驗結果繪制擴增曲線，產生熔解曲線，以β-actin基因作為內參，用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。引物的主要序列情況見表1。

1.2.6Western blot法檢測小鼠腹腔巨噬細胞中iNOS、IL-1β及自噬相關蛋白的表達 將小鼠腹腔中的巨噬細胞取出并進行離心操作，PBS洗滌3次棄上清液，加入裂解液，離心收集上清液，SDS-PAGE凝膠電泳轉移至PVDF膜，封閉2 h。膜與一抗4 ℃孵育過夜，一抗為：LC3-Ⅰ(1 ∶10 000)；LC3-Ⅱ(1 ∶900)；LAMP2(1 ∶300)；Beclin1(1 ∶1 000)；p62(1 ∶300)；IL-1β(1 ∶300)；pro-IL-1β(1 ∶300)；iNOS抗體(1 ∶300)。PBST洗膜3次，加入一定量的辣根過氧化物酶進行二抗標記，在室溫條件下孵育，并進行3次PBST洗滌，顯影。該實驗以β-actin作為內參，應用ECL發光試劑盒對蛋白檢測，應用ImageJ軟件系統分析評價蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 RvD1對實驗性結腸炎小鼠腸道炎癥的影響相比較正常對照組，模型對照組DAI評分提升，HI評分有所增加，MPO含量上升，與模型對照組比較，RvD1給藥組DAI評分、HI評分和MPO含量減低(P<0.05)，見圖1A、B、C。結腸組織病理學觀察發現模型對照組結腸組織可見大量炎性細胞浸潤，黏膜上皮細胞形態改變，杯狀細胞、隱窩減少；RvD1給藥組結腸組織炎性細胞浸潤減少，隱窩數量基本正常。見圖1D。

2.2 RvD1對實驗性結腸炎小鼠結腸組織細胞因子含量的影響相比正常對照組，模型對照組小鼠結腸組織IL-1、IL-6、TNF-α的含量提升，IL-10水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。相比較模型對照組，在RvD1給藥組中，小鼠結腸組織IL-1、IL-6、TNF-α的水平降低，IL-10含量增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 實時熒光定量PCR法引物序列

表2 RvD1對實驗性結腸炎小鼠結腸組織細胞因子含量的影響

與正常對照組比較：*P<0.05;與模型對照組比較：#P<0.05

2.3 RvD1對實驗性結腸炎小鼠腹腔巨噬細胞自噬體結構的影響在實驗中通過透射電鏡觀察小鼠腹腔巨噬細胞并對巨噬細胞自噬泡體積分析可以發現，相比較正常對照組，模型對照組自噬泡體積增大，RvD1給藥組小鼠腹腔巨噬細胞內自噬泡與模型對照組相比較體積縮小，見圖2。

2.4 RvD1對實驗性結腸炎小鼠腹腔巨噬細胞中IL-1β、iNOS及自噬相關表達的影響相比較正常對照組，在模型對照組中，小鼠腹腔巨噬細胞內Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA及其蛋白表達量降低，iNOS、IL-1β、p62 mRNA及其蛋白表達量增加(P<0.05)。與模型對照組比較，RvD1給藥組小鼠腹腔巨噬細胞內Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ mRNA及其蛋白表達量提升，iNOS、IL-1β、p62 mRNA及其蛋白表達量降低(P<0.05)。見圖3。

3 討論

IBD是一種腸道慢性復發性炎癥性疾病，近年來發病率逐漸增高并且病程反復、難以治愈。目前主要臨床治療用藥5-氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑等存在藥物不良反應，開發新型高效安全的藥物十分重要。

圖1 RvD1對DSS結腸炎小鼠腸道炎癥的影響

A：各組小鼠每日DAI變化比較；B：各組小鼠每日HI變化比較; C：各組小鼠每日MPO變化比較；D：各組小鼠結腸組織病理變化(HE染色×400)； 1：正常對照組；2：RvD1對照組；3：模型對照組；4：RvD1給藥組；與正常對照組比較：*P<0.05；與模型對照組比較：#P<0.05

圖2 RvD1對實驗性結腸炎小鼠腹腔巨噬細胞自噬體結構的影響 ×200A:正常對照組；B：RvD1對照組；C：模型對照組；D：RvD1給藥組

圖3 RvD1對實驗性結腸炎小鼠腹腔巨噬細胞中IL-1β、iNOS等自噬相關表達的影響

A：各組小鼠腹腔巨噬細胞中IL-1β、iNOS、Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的蛋白表達水平；B：各組小鼠腹腔巨噬細胞中IL-1β、iNOS、Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的mRNA表達水平；1：正常對照組；2：RvD1對照組；3：模型對照組；4：RvD1給藥組；與正常對照組比較：*P<0.05；與模型對照組比較：#P<0.05

RvD1是一種具有抗感染作用的多不飽和脂肪酸衍生物，Bento et al[5]、Liao et al[6]研究提示RvD1可以減輕機體炎癥反應，但RvD1對結腸炎的作用尚不清楚。本實驗中RvD1給藥組DAI評分、HI評分和MPO含量低于模型對照組，RvD1給藥組結腸黏膜炎性細胞浸潤減少。同時結腸組織內IL-1、IL-6、TNF-α含量降低，IL-10含量提升。將RvD1應用于結腸炎中可以改善腸道炎癥損傷。

自噬是一類高度保守的降解途徑，機體炎癥過程中產生的線粒體活性氧等物質，可以通過細胞自噬達到清除，維持機體的穩態[4]。當自噬受到限制時，mtDNA釋放，活性氧產生和P62堆積，觸發NF-κB信號通路激活和炎癥體活化，促進炎癥因子合成，加重器官炎癥損傷。當自噬受損時細胞內可形成較大的液泡，自噬泡的半衰期延長[11]。本實驗顯示模型對照組小鼠腹腔巨噬細胞內可見自噬泡數量增多及自噬泡體積增大，提示自噬通路受損。給予RvD1處理，自噬泡數量減少。在自噬體形成的過程中，Beclin1與Vps34結合形成Beclin1-Vps34-Vps15復合體，介導自噬泡定位，促使自噬前體形成[12]。LAMP2作為溶酶體膜上高度表達的蛋白，在自噬體與溶酶體的融合過程中發揮重要作用[13]。LC3總量一般不會變動，可由自噬溶酶體降解導致LC3-Ⅱ減少或LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ之間的相互轉化，反映自噬流狀態[14]。當LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值減小表示自噬受限或自噬過度活化，比值增大表示自噬活化。P62在細胞自噬中起著識別以及轉運待降解底物的重要作用，自噬抑制時P62含量增加[15]，自噬活化時P62水平降低。本研究顯示模型對照組小鼠Beclin-1、LAMP-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平減低，iNOS、IL-1β、p62表達增加，提示自噬受損，RvD1組小鼠巨噬細胞自噬相關蛋白異常表達改善。在結腸炎中應用RvD1可以進一步抑制炎癥發生的相關機制，也許與修復小鼠細胞自噬通路，調控促炎細胞因子表達有關，這為IBD的藥物治療提供新的實驗依據。