維生素D及維生素D受體在慢性乙型肝炎患者體內表達水平及抗病毒相關機制的研究

汪玲妹，管世鶴，張 浩，楊 凱，汪 靜，嚴榮榮，李太平，李 姣

維生素D(vitamin D，Vit D)是一種常見的維生素，既往認為其主要參與機體骨鈣磷代謝，最新研究[1]表明Vit D具有調節先天性免疫和適應性免疫的重要作用，且Vit D缺乏與各種自身免疫性疾病、病原體感染等風險增加相關。Vit D的基線水平與VDR基因多態性影響病毒性肝炎的自然病程以及聚乙二醇化干擾素(pegylated interferon，Peg-IFN)治療的反應[2-3]。進一步研究[4]發現，Vit D能夠通過增強IFN-α誘導的基因表達，增強IFN-α對丙型肝炎病毒復制的抑制作用，而非活性維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)能夠結合STAT1進而抑制JAK-STAT信號轉導途徑。目前，關于Vit D、VDR在CHB中作用尚未完全清楚, 為此該研究分析了CHB患者Vit D、VDR表達與乙型肝炎相關指標關系，同時通過體外細胞系研究Vit D和IFN-α單獨及聯合處理對HBV復制水平的影響及其可能存在的機制，從而為臨床抗HBV治療提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑和儀器 MEM培養液購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自杭州四季青公司；細胞培養雙抗購自上海碧云天生物科技有限公司；IFN-α購自合肥安科生物公司；Vit D試劑購自上海阿拉丁公司；抗干擾素調節因子9(IFN regulatory factor-9，IRF-9)抗體、抗粘病毒A蛋白(Mx GTPase A，MxA)抗體、抗-VDR抗體均購自英國 Abcam 公司；抗-β-actin 抗體購自美國Affinity公司；山羊抗兔 IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司； ECL底物發光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.1.2病例資料 選取2018年1～12月在安徽醫科大學第二附屬醫院感染科收治的CHB患者共計 81例，男63例，女18例。CHB的診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年版)》。排除標準：① 存在其他肝臟疾病如丙型病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化等；②曾接受干擾素和或核苷(酸)類藥物抗病毒治療；③ 癌癥或其他嚴重的慢性疾病；④ 近3個月服用Vit D制劑。選擇同期體檢人群健康者40例作為健康對照(health control,HC)組。

1.2 方法

1.2.1肝功能指標、Vit D及HBV相關指標定量檢測 肝功能指標如：丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，ALB)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、r-谷氨酰基轉移酶(gamma-glutamyl transferase，GGT) 由德國西門子全自動生化分析儀 Dimension EXL TM with LM檢測，Vit D及 HBV血清學指標分別由瑞士羅氏全自動電化學發光分析儀 Cobas e602和雅培全自動化學發光分析儀 i4000 SR檢測。HBV DNA 定量檢測按照檢測試劑盒(上海復星長征醫學科學有限公司)說明書步驟操作。

1.2.2免疫組織化學染色檢測CHB患者肝組織中VDR表達 肝穿標本經超聲引導下穿刺取得，采用Power Vision TM二步法對肝組織標本進行染色，操作嚴格按照產品說明書進行，染色結果由光學顯微鏡下觀察得到。

1.2.3細胞培養及處理 HepG2.2.15細胞以 MEM 培養液添加10% FBS、105IU/L青霉素、105IU/L鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2條件下培養。細胞計數后, 按5×105/孔接種于12孔板，待HepG 2.2.15細胞生長到70%～80%融合時進行處理，分為空白組、IFN-α(105IU/L)處理組、Vit D(1 μmol/L)處理組和聯合處理組。加藥處理后置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h。

1.2.4Western blot技術分析 細胞PBS沖洗3次，各孔加含PMSF(體積比1 ∶100)的RIPA裂解液100 μl，冰上裂解30 min后刮取細胞至EP管，離心(15 000 r/min、30 min，4 ℃)后收集上清液，BCA法進行蛋白定量，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min，冷卻，配膠(10%分離膠+5%濃縮膠)電泳分離，半干轉法轉移到PVDF膜上，室溫下用封閉液(5%的牛奶)封閉1 h，TBST清洗3次，加入一抗(抗-IRF-9抗體：1 ∶2 000；抗-MxA抗體：1 ∶1 000；抗-VDR抗體：1 ∶1 00)中4 ℃震蕩過夜，第2天清洗后于室溫下二抗(山羊抗兔 IgG抗體：1 ∶5 000)中孵育1 h，清洗待用。吸取等量的ECL 2種試劑，混合均勻后均勻涂抹在PVDF膜表面，在自動顯影儀上曝光，β-actin 作為內參。

2 結果

2.1 人口學資料及實驗室指標本研究納入CHB組81例，健康對照組(health control，HC)40例，兩組年齡及性別特征無統計學差異。與HC組比較，CHB組患者肝功能指標ALT、AST、ALB、ALP、GGT差異有統計學意義(P≤0.001)(表1)。

表1 研究對象基本資料

2.2 CHB患者血清Vit D含量及分布血清Vit D含量在CHB組和HC組分別為(25.04±7.50) ng/ml和(27.71±5.55)ng/ml，差異有統計學意義(P<0.05)。目前廣泛接受的Vit D含量定義為正常(>30 ng/ml)、不足(20 ～30 ng/ml)、缺乏(<20 ng/ml)[5]。CHB組中患者血清Vit D含量正常、不足、缺乏比例分別為24.69%(20/81)，45.68%(37/81)、29.63%(24/81)；HC組中Vit D含量正常、不足、缺乏比例分別為30%(12/40)、65%(26/40)、5%(2/40)，CHB患者不同含量Vit D構成與HC組相比差異有統計學意義(P<0.001)(圖1)。

2.3 CHB患者血清Vit D水平與肝功能、HBV血清學指標相關性ALT、AST、ALB和 TBIL 是評估CHB嚴重程度常用的生化指標，尤其 ALT 和AST在CHB臨床分期和治療中具有重要意義。通過Pearson和Spearman相關分析，CHB組血清Vit D水平與ALB呈正相關性(r=0.339，P=0.002)，而與其它肝功生化指標 ALT、AST、TBIL、ALP、GGT間無相關性；CHB 患者血清Vit D水平與HBV DNA呈負相關性(r=-0.274，P=0.013)，與HBsAg 、HBcAb無相關性。HBeAg陽性患者血清Vit D水平(23.43±7.86)ng/ml與HBeAg陰性患者Vit D水平(26.77±6.78)ng/ml相比差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.4 CHB分期與血清Vit D、肝組織中VDR表達關系據ALT、AST、TBIL、ALB等指標將CHB患者分為輕度(n=19)、中度(n=49)、重度(n=13)。血清Vit D水平與CHB嚴重程度相關，中度CHB患者血清Vit D水平(25.46±6.53)ng/ml及重度CHB患者血清Vit D水平(17.19±3.04)ng/ml低于輕度CHB患者血清Vit D(29.98±7.77)ng/ml，且重度CHB患者血清Vit D水平低于中度CHB患者血清Vit D(圖3A)。免疫組化染色顯示，CHB患者肝組織VDR表達較健康人群降低，且隨肝炎嚴重程度加重而表達下降(圖3B)。

2.5 Vit D和IFN-α單獨及聯合處理HepG2.2.15細胞后HBV血清學指標及VDR、MxA、IRF-9蛋白表達水平分析經 Vit D單獨及聯合IFN-α處理HepG2.2.15細胞后，與空白組相比，IFN-α+Vit D聯合處理組對 HepG2.2.15細胞分泌 HBsAg、HBeAg的抑制作用大于 IFN-α組和Vit D組；與IFN-α 組相比，IFN-α+Vit D聯合處理組上清液中HBsAg、HBeAg分泌下降，其中HBsAg差異有統計學意義(P<0.05)。運用實時熒光定量 PCR分析細胞上清液HBV DNA，各處理組未見明顯抑制作用(表2)。經Vit D單獨及聯合IFN-α處理后，HepG2.2.15 內VDR、IRF-9 和MxA 蛋白的表達量增高(圖4)。

圖1 CHB組和HC組血清Vit D含量及分布

圖2 CHB患者血清Vit D水平與ALB、HBV DNA關系

圖3 CHB分期與血清Vit D、肝組織中VDR表達水平關系 ×200

A：不同程度CHB患者血清Vit D水平；B：VDR在CHB患者及正常肝組織中的表達；a：正常；b：輕度；c：中度；d：重度；與輕度CHB比較：*P<0.05，***P<0.001； 與中度CHB比較：###P<0.001

表2 Vit D和IFN-α單獨及聯合處理后細胞培養上清液HBV血清學指標

與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01； 與IFN-α組比較：#P<0.05

圖4 Vit D和IFN-α單獨及聯合處理后細胞VDR、MxA、IRF-9蛋白表達水平

3 討論

Vit D活性形式為1, 25(OH)2D3，一般認為經食物或光照來源的Vit D前體首先在肝臟中被羥化成25(OH)D3，隨后在腎臟中被羥化成1, 25(OH)2D3。近來研究[6]發現，Vit D代謝酶也存在于多種組織中，如胎盤、皮膚和免疫細胞，同時，某些信號如IFN或Toll樣受體可刺激相關酶表達，使巨噬細胞產生具有生物活性的代謝物1, 25(OH)2D3。Chen et al[7]長期隨訪128例初治CHB患者發現，CHB患者基線Vit D水平明顯低于健康人群，與血清HBV DNA載量呈負相關，經過核苷(酸)類似物治療后，整體Vit D水平有所上升，且發生e抗原轉換CHB患者血清Vit D水平高于e抗原持續陽性患者，提示CHB患者體內Vit D水平對抗病毒療效有一定的預測價值。本研究通過分析健康體檢者、初治CHB患者血清Vit D水平與實驗室參數間關系，表明CHB患者血清Vit D水平低于健康體檢者，與HBV DNA載量、e抗原狀態相關，這也與Chen et al[7]研究一致。

VDR是一種48 ku大小的可溶性蛋白，屬于核受體超家族成員，幾乎所有組織中都有表達，與Vit D通過配體-受體模式激活，作用于靶基因上的特定DNA序列，進而調節結構基因的表達[8]。研究[9]表明慢性丙型肝炎患者肝臟VDR表達顯著低于健康人群，與肝臟損傷嚴重程度密切相關，并且在獲得完全病毒學應答的患者中肝臟VDR表達高于未獲得患者，提示慢性丙型肝炎患者體內可能存在Vit D/VDR信號通路的功能下降，進而影響抗病毒效果乃至疾病進程。同樣，有體外實驗[10]發現VDR在HBV轉染細胞中表達下調，相應減少了CAMP、TNF-α等因子表達，不利于Vit D發揮對HBV轉錄和翻譯的抑制作用。此外，有研究[11]報道Vit D可通過VDR抑制TGF-1/SMAD3信號通路，從而抑制肝星狀細胞激活以此減輕肝纖維化，通過長期隨訪提出Vit D基因多態性與丙型肝炎進展有關。本研究顯示CHB患者血清Vit D、肝組織中VDR表達與CHB嚴重程度負相關，提示CHB患者體內可能也存在Vit D/VDR信號通路的功能下降，這可能不利于藥物發揮抗病毒作用，甚至加速CHB轉變為肝纖維化乃至肝硬化的進程。

有研究[12]表明，Vit D可誘導IFN介導的信號通路的表達，進而發揮抗丙型肝炎病毒效應。本研究顯示Vit D處理后HepG2.2.15細胞內抗病毒蛋白MxA表達升高，同時細胞分泌的HBV相關抗原出現下降趨勢，提示Vit D可能通過作用于IFN-α JAK-STAT通路，上調抗病毒蛋白MxA表達，進而影響病毒復制。另有研究[6]發現，Vit D與 IFN-α發揮協同效應，增強IFN-α抗病毒活性。本研究進一步采用 Vit D與IFN-α聯合處理HepG2.2.15 細胞，顯示IRF-9 和MxA 蛋白的表達及對HBV抗原抑制作用較IFN-α單獨處理增強，與其研究一致，表明Vit D可能通過增強HepG2.2.15細胞JAK-STAT途徑分子IRF-9及下游抗病毒蛋白MxA的表達，抑制HepG2.2.15細胞HBV抗原分泌，增強IFN-α的藥效。同時，Bi et al[13]發現較IFN-α單獨處理，Vit D與IFN-α聯合處理乙型肝炎模型小鼠病毒復制及抗原分泌顯著降低，有較好的預后，這可能是加強了藥物療效帶來的良好反應。因此，定期監測及維持CHB患者體內一定的Vit D水平可能有助于CHB患者的病情評估以及疾病控制。