過表達miR-34a脂肪干細胞外泌體調控增生性瘢痕成纖維細胞增殖及凋亡的研究

肖向陽，鄭德義，王寶云，李自力

長期愈合的軟組織傷口容易形成瘢痕，這不利于傷口愈合質量[1]。因此，縮短軟組織創傷愈合時間，減少瘢痕形成，是臨床急需解決的問題。脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)能分泌多種可溶性因子，如生長因子、細胞因子、胞外體等[2]。外泌體是一個40～100 nm大小的細胞外小泡，形成于胞質并釋放到細胞外環境[3]。研究[4]表明ADSCs或其外泌體能夠促進真皮成纖維細胞在傷口愈合過程中的遷移，并且在促進皮膚或黏膜軟組織創傷修復中有積極作用。miRNAs在細胞增殖凋亡等各種細胞反應中具有重要要作用，研究[5]表明miR-34a在ADSCs作用中過表達能影響細胞周期及增殖，但在ADSCs外泌體干預人增生性瘢痕成纖維細胞(hypertrophic scar fibroblasts，HSF)增殖凋亡情況中的作用尚不可知。因此該研究以HSF為研究對象，將其與過表達miR-34a的ADSCs外泌體共培養后，探討miR-34a在ADSCs外泌體影響HSF增殖、凋亡過程中的具體作用機制，以期為臨床研發新的治療瘢痕疙瘩的治療方案提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料人脂肪組織來源于貴州省人民醫院整形外科的一名27歲進行吸脂術的健康女性，術前簽署知情同意書；HSF購自上海素冉生物科技有限公司；miR-34a過表達及其陽性對照慢病毒(2×108PFU/ml)購自上海漢恒生物科技有限公司；DMEM培養基購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；胰蛋白酶和膠原酶購自美國Gibco公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、ECL化學發光試劑盒以及蛋白酶抑制劑均購自上海碧云天生物技術有限公司；qRT-PCR 試劑盒和逆轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；兔抗人cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、Ⅰ型膠原蛋白(COL Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(COL Ⅲ)、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1和GAPDH抗體、兔抗人CD90、CD31、CD45、CD81、CD63、小鼠抗人CD105及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 均購自英國Abcam公司；ExoQuick-TC外泌體沉淀液購自美國System Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1ADSCs的分離及鑒定 用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline，PBS)洗滌脂肪組織后，將脂肪組織切成約25～50 μm的片狀，用0.1%膠原酶在37 ℃下消化1 h，通過100 μm濾網過濾消化物，去除組織碎片獲得單細胞懸液。1 000 r/min 離心5 min分離含有ADSCs的細胞懸液，共離心6次。將ADSCs按5×107個/ml的濃度接種于培養瓶中。于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養72 h后，去除未貼壁細胞。每2 d換1次培養液，當細胞融合率達到80%后繼續傳代培養。取第3代細胞上流式細胞儀檢測ADSCs表面分子標志物CD31、CD45、CD90、CD105的表達水平，并采用成骨誘導劑誘導分離出的ADSCs 成骨分化21 d，再使用茜素紅和堿性磷酸酶染色觀察ADSCs成骨分化能力。

1.2.2細胞感染 取對數生長期ADSCs，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞生長至70%融合度時，按照病毒感染比率值(MOI)50 ∶1分別加入miR-34a過表達慢病毒及其陰性對照慢病毒感染ADSCs，另取選用不做任何處理的ADSCs細胞作為對照，分別記為ADSCs/miR-34a組、ADSCs/miR-NC組和ADSCs組。培養6 h后，更換新鮮培養液，72 h后采用1 mg/L嘌呤霉素篩選穩定表達株。

1.2.3外泌體提取及鑒定 將ADSCs在無血清培養基中培養24 h，加入胰蛋白酶消化后收集培養基，3 000 r/min離心30 min去除細胞碎片，通過0.22 μm微孔過濾器。得到細胞上清液，再用微孔離心過濾裝置100 000 r/min離心2 h濃縮，然后用ExoQuick-TC外泌體沉淀溶液孵育過夜。PBS將得到的外泌體重懸后，BCA測定其濃度后置于-80 ℃備用。透射電子顯微鏡觀察收集到的外泌體形態，通過Western blot法檢測外泌體標志物蛋白CD63和CD81的表達。根據不同分組ADSCs細胞提取的外泌體分為3組，分別為ADSCs外泌體(ExoADSCs)、ADSCs/miR-NC外泌體(ExoADSCs/miR-NC)和ADSCs/miR-34a外泌體(ExoADSCs/miR-34a)。

1.2.4外泌體與HSF細胞共培養 取對數生長期HSF細胞，以5×107個/孔的密度接種于6孔板中，血清饑餓培養24 h后，分為HSF+PBS組、HSF+ExoADSCs組、HSF+ ExoADSCs/miR-NC組和HSF+ExoADSCs/miR-34a組，分別加入含有不同外泌體及等量PBS溶液的新鮮無血清培養基繼續培養48 h，收集細胞進行后續檢測。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-34a的表達水平 采用TRIzol法提取各組ADSCs細胞及其外泌體總RNA，分光光度計測量RNA純度。采用逆轉錄酶將總RNA反轉錄到cDNA，根據SYBR綠色熒光實時定量PCR試劑盒說明書，進行PCR檢測。其中所用引物為miR-34a：forward 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGAACAACCA-3′；reverse 5′-ACACTCCAGCTGGGTGGCAG TGTCTTAGCTG-3′；U6：forward 5′-CTCGCTTCGCAGCACA-3′；reverse 5′-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件：94 ℃、2 min，94 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s(40個循環)。以U6為內參，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達。

1.2.6Western blot檢測外泌體標志蛋白的表達水平 采用不同外泌體處理HSF細胞48 h，棄培養基，收集各組細胞，采用RIPA細胞裂解液冰上裂解細胞后，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后取上清液，使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。高溫變性后取25 μg蛋白上樣，用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白質，并轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入一抗體兔抗人cleaved-Caspase-3(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、COL Ⅰ(1 ∶1 000)、COL Ⅲ(1 ∶1 000)、p-Smad2(1 ∶300)、p-Smad3(1 ∶2 000)、TGF-β1(1 ∶100)、CD81(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶結合二級抗體(1 ∶10 000)常溫孵育2 h，使用ECL化學發光法對蛋白質進行化學發光，顯影和定影，將得到的膠片進行拍照后用凝膠圖像處理系統分析目的條帶。

1.2.7MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期HSF細胞，以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設置3個復孔。待細胞生長至70 %融合度時，采用不同外泌體處理的HSF細胞48 h，棄培養基，將10 μl MTT(0.5 mg/ml)加入各孔中孵育4 h，去除上清液，加入200 μl DMSO終止反應。將細胞在37 ℃下再培養15 min，使用Bio-Rad酶標儀在c490 nm波長處檢測每個孔的吸光度(optical density,OD)值。

1.2.8流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期HSF細胞，以2×104個/孔的密度接種于6孔板中，待細胞生長至70%融合度時，采用不同外泌體處理HSF細胞48 h，棄培養基，用PBS清洗細胞后，胰酶消化并收集細胞，200 r/min離心5 min，棄上清液后重懸細胞，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶(propidium lodide，PI)混勻，室溫避光孵育10 min，200 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.5 ml PBS重懸，立刻用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 ADSCs的鑒定流式細胞術結果(圖1A)顯示，ADSCs的表面抗原CD90、CD105呈陽性表達，而CD31、CD45呈陰性表達。將ADSCs進行成骨誘導后，茜素紅染色結果可見大量橘紅色鈣結節(圖1B)，堿性磷酸酶染色結果可見胞質內出現藍色沉淀(圖1C)。說明，ADSCs分離成功。

2.2 ADSCs外泌體的鑒定經透射電子顯微鏡掃描顯示，發現大部分呈雙層膜結構的圓形或橢圓形囊泡狀小體，直徑為50～100 nm(圖2A)。Western blot結果顯示，與細胞溶解物比較，所提取物質中外泌體特異性表達標志物CD63和CD81高表達(圖2B)。結果表明，所提取物質為外泌體。

圖1 ADSCs的鑒定

圖2 ADSCs外泌體的鑒定

A：透射電鏡顯微鏡觀察ADSCs外泌體 Bar scale=100 nm，×140 000；B：Western blot法檢測ADSCs的細胞裂解物和外泌體中CD81和CD63蛋白的表達水平

2.3 慢病毒感染后ADSCs及其外泌體中miR-34a表達水平比較qRT-PCR結果顯示，與ADSCs和ADSCs/miR-NC組比較，ADSCs/miR-34a組的miR-34a的表達水平升高(F=198.600，P<0.05)；與ExoADSCs和 ExoADSCs/miR-NC組比較，ExoADSCs/miR-34a組的miR-34a的表達水平升高(F=139.700，P<0.05)。見圖3。

1.市場主導原則。按照市場規律，在線上線下互動創新發展中發揮市場配置資源的基礎性作用，尊重企業的市場主體地位，并充分相信轄區企業和企業經營者的智慧，尊重企業“+電子商務”的自主經營權。

圖3 ADSCs與外泌體的miR-34a的表達水平

A：慢病毒感染ADSCs后miR-34a的表達水平；B：慢病毒感染ADSCs后，其外泌體中miR-34a的表達水平；1：ADSCs；2：ADSCs/miR-NC；3：ADSCs/miR-34a；a：ExoADSCs；b：ExoADSCs/miR-NC；c：ExoADSCs/miR-34a；與ADSCs或ADSCs/miR-NC組比較：*P<0.05；與ExoADSCs或ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05

2.4 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF增殖能力的影響MTT 24、48、72 h結果顯示，HSF+PBS組、HSF+ExoADSCs組、HSF+ExoADSCs/miR-NC組和HSF+ExoADSCs/miR-34a組細胞組間增殖能力差異有統計學意義(F=108.721，P<0.05；F=206.433，P<0.05；F=213.148，P<0.05)；與HSF+PBS組比較，HSF+ExoADSCs組HSF細胞增殖能力降低(P<0.05)；與HSF+ExoADSCs和HSF+ ExoADSCs/miR-NC組比較HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細胞增殖能力降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞增殖能力的影響

與HSF+PBS組比較：*P<0.05；與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05

2.5 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞凋亡的影響如圖5、6所示，與HSF+PBS組比較，HSF+ExoADSCs組 HSF細胞凋亡率升高，促凋亡蛋白cleaved-Caspase-3和Bax蛋白水平也升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與HSF+ExoADSCs和HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較，HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細胞凋亡率升高，cleaved-Caspase-3和Bax蛋白水平也升高，而Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。

2.6 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF纖維化及TGF-β/Smad信號通路相關蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示，與HSF+PBS組比較，HSF+ExoADSCs組HSF細胞COL Ⅰ、COL Ⅲ、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05)；與HSF+ExoADSCs和HSF+ ExoADSCs/miR-NC組比較，HSF+ExoADSCs/miR-34a組HSF細胞COL Ⅰ、COL Ⅲ、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05)，見圖7。

3 討論

脂肪組織廣泛分布于人體內，在生理狀態下對鄰近的軟組織起著重要的支持和保護作用。同時，脂肪組織作為一種活躍的內分泌器官，也是新陳代謝、生長發育、抗感染等生物學過程中的關鍵因素。自體脂肪移植用于復雜的傷口修復，在整形手術中也常用于軟組織再生，脂肪間充質干細胞，在軟組織創傷修復中發揮著重要作用[6]。但其作用機制尚不清楚。目前加速愈合和減少瘢痕形成的傳統方法包括皮膚移植[7]、激光治療[8]和局部應用一些生長因子[9]。然而，這些方法可能導致萎縮性瘢痕、色素異常、皮膚壞死等不良后果[10]。此外，局部注射因子很容易被體液降解，并且其劑量和濃度在傷口處經常發生較大的變化[11]。因此，有必要尋找一種穩定、有效、安全的新方法來促進軟組織創面的愈合。

圖5 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞凋亡的影響

A：HSF+PBS；B：HSF+ExoADSCs；C：HSF+ExoADSCs/miR-NC；D：HSF+ExoADSCs/miR-34a；與HSF+PBS組比較：*P<0.05；與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05

圖6 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞凋亡相關蛋白表達的影響

1：HSF+PBS；2：HSF+ExoADSCs；3：HSF+ExoADSCs/miR-NC；4：HSF+ExoADSCs/miR-34a；與HSF+PBS組比較：*P<0.05；與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05

外泌體中miRNAs含量豐富且參與細胞大多數生理過程。miR-34a作為腫瘤抑制子，也對心肌成纖維化具有一定作用[14]。miR-34a是硬化成纖維細胞的潛在重要生物靶點，其通過調節Smad4促進TGF-β1誘導的心肌成纖維化細胞增殖、轉分化和膠原分泌[14]。但在皮膚的成纖維細胞中miR-34a的作用沒有相關研究報道。已有研究[15]證實抗凋亡蛋白Bcl-2是miR-34a的功能靶點，miR-34a通過與3’-UTR結合抑制Bcl-2的表達水平，進而促進腫瘤細胞凋亡。另外，miR-34a能抑制ADSCs的成骨成脂分化，并且降低了CDKs和Cyclins等多種細胞周期調控因子的表達，在細胞S期積累分裂細胞，抑制ADSCs的增殖[5]。這些研究報道從側面證明了miR-34a對ADSCs增殖凋亡以及細胞纖維化有一定的作用。本研究結果顯示，miR-34a過表達的ADSCs外泌體能有效抑制HSF的增殖，促進細胞凋亡，并且通過下調TGF-β/Smad、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達抑制HSF的纖維化和膠原合成來減少瘢痕的生成。從miRNAs水平闡述了ADSCs外泌體對瘢痕成纖維細胞的作用，對臨床上開發新的治療方案提供了有力的證據。

圖7 過表達miR-34a的ADSCs外泌體對HSF細胞纖維化及TGF-β/Smad信號通路相關蛋白表達的影響

1：HSF+PBS；2：HSF+ExoADSCs；3：HSF+ExoADSCs/miR-NC；4：HSF+ExoADSCs/miR-34a；與HSF+PBS組比較：*P<0.05；與HSF+ExoADSCs或HSF+ExoADSCs/miR-NC組比較：#P<0.05.