橋本甲狀腺炎對妊娠早期小鼠海馬5-羥色胺及受體的影響

夏 琴，楊 昊，柳田田，程 錦，吳章碧，王 囡，朱德發

橋本甲狀腺炎(hashimoto’s thyroiditis，HT)是一種自身免疫性疾病，又稱慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，多發于女性[1]。其特征為血清甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、抗甲狀腺球蛋白抗體(thyroid globulin antibody，TGAb)滴度顯著升高，伴部分甲狀腺濾泡破壞、甲狀腺淋巴細胞浸潤。近年來臨床[2-3]發現妊娠合并TPOAb、TGAb陽性患者情緒障礙的發病率增加。5-羥色胺(5- hydroxytryptamine，5- HT)是一種參與情緒調節的重要神經遞質，其神經元位于腦干中縫核投射大腦半球的許多區域，包括前額葉皮質、海馬、伏隔核、紋狀體等[4]。5-HT有7種受體，可通過與受體作用發揮多種生理功能。 其中5-羥色胺2c受體(5 -hydroxytrptamine2c receptor，5-HT2CR)與情緒反應密切相關[5]。現通過建立妊娠早期HT小鼠模型，觀察其海馬5-HT和5-HT2CR含量及分布是否受到影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物5～6周齡NOD雌性小鼠70只，雄性小鼠16只，體質量20～23 g，取自北京華阜康生物科技有限公司，在安徽醫科大學實驗動物中心SPF級動物實驗室標準條件(室溫20～24 ℃，濕度55%)下喂養。

1.2 主要試劑及儀器豬甲狀腺球蛋白(porcine thyroglobulin，pTg)、完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)均購自美國Sigma公司;游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)試劑盒、游離四碘甲狀腺原氨酸(free tetraiodothyronine，FT4)試劑盒、TGAb、TPOAb試劑盒均購自德國Rocha公司;促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)ELISA試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司;HE染色試劑盒購自上海科匯生物技術有限公司；5- HT ELISA試劑盒(瑞士Enzo公司，ADI-900-175)；兔抗鼠5-HT2CR 抗體(北京博奧森公司，bs-2959 R);免疫組織化學染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；熒光顯微鏡(日本Olympus公司) ;形態學圖像分析系統(Image-ProPLus 6.0，美國MEDIA CYBERNETICS公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1動物模型制備 適應性喂養1周后，將70只NOD雌性小鼠隨機均分為2組：正常懷孕組(CON組)、HT懷孕組(HT組)。造模步驟：將25 μg pTg溶于100 μl生理鹽水溶液中，CFA與pTg溶液1：1混合于研缽中，冰浴條件下研磨至完全乳化。在HT組小鼠尾部皮下注射0. 1 ml/只。CON組注射含有等量生理鹽水的CFA乳化劑。14 d后將CFA替換成IFA，與pTg制備成乳化液，同樣操作方法在HT組小鼠尾根部1 cm處皮下注射0.1 ml/只。在CON組注射等量不含pTg的IFA乳化劑。7周后將2組小鼠分別以2 ∶1比例隨機與雄鼠合籠，檢到陰栓記為0.5 d，4.5 d造模結束。每組各隨機選取16只孕鼠進行實驗。本實驗經實驗動物倫理審查。

1.3.2血清制備及甲狀腺激素水平測定 對小鼠深度麻醉后處死，打開小鼠腹腔，用1 ml注射器行下腔靜脈采血。4 ℃冰箱靜置6～8 h，高速離心機15 000 r/ min離心15 min 2次，分離血清。ECLIA檢測FT3、FT4、TGAb、TPOAb；ELISA檢測血清TSH。

1.3.3標本制備 小鼠處死后，在冰上迅速解剖腦組織，左側腦組織固定于多聚甲醛中24 h后，石蠟包埋，連續矢狀位切片(5 μm厚)。右側腦組織迅速分離出海馬組織放置無酶管中，-80 ℃冰箱保存；分離甲狀腺，固定在多聚甲醛中，石蠟包埋，每只小鼠選取5個不相鄰的冠狀位切面。

1.3.4甲狀腺HE染色 甲狀腺石蠟切片經二甲苯脫蠟后、各級乙醇水洗后，蘇木精染料染色15 min，鹽酸乙醇分化后水洗返藍后，伊紅染色10 s，再經脫水、封片。光學顯微鏡下拍攝圖片。

1.3.5ELISA檢測海馬5-HT表達 在涂有GxR IgG抗體的孔中加入標準品和樣品，隨后加入與堿性磷酸酶結合的5-HT溶液，再加入兔血清素多克隆抗體溶液。在室溫下同時孵育期間，抗體以競爭性的方式與樣品或結合物中的5-HT結合，然后加入pNpp基體溶液。堿性磷酸酶催化5-HT偶聯物致底物變成黃色，添加停止液。酶標儀405 nm處測定吸光度(optical density,OD)值。計算樣本中5-HT的濃度。

1.3.6海馬5-HT2CR總蛋白提取和Western blot

1.3.6.1 海馬總蛋白提取 取海馬組織置于1.5 ml EP管中，加入組織裂解液及蛋白酶抑制劑，電動勻漿器冰上勻漿。4 ℃、15 000 r/min離心15 min;重復操作1次;用BCA法對樣品進行蛋白定量。按比例樣品中加入5×蛋白電泳上樣緩沖液，然后熱浴鍋100 ℃、10 min蛋白變性，-20 ℃冰箱分裝保存。

1.3.6.2 Western blot 各樣本上樣量18 μg，加電泳緩沖液進行SDS-PAGE電泳;轉膜3 h，麗春紅染色;脫脂牛奶室溫封閉2 h;GAPDH(1 ∶4 000) 室溫孵育40 min，一抗5-HT2CR(1 ∶500) 室溫孵育120 min;GAPDH二抗(1 ∶150 000)室溫孵育40 min，5-HT2CR 二抗(1 ∶100 000)室溫孵育120 min。麗春紅染色后三蒸水水洗3次，每次10 min，牛奶封閉后水洗3次7 min,一抗二抗用PBST清洗3次+PBS清洗，各10 min。滴加超敏顯影液置化學發光成像儀顯影，運用IPP 6.0分析蛋白條帶灰度值。

1.3.7免疫組織化學法 將海馬石蠟切片放置60 ℃烤箱30 min，二甲苯脫蠟3 次10 min，乙醇梯度降低水化;PBS+Triton X-100+30%過氧化氫細胞通透;枸櫞酸鈉鹽加熱修復抗原暴露抗原決定簇;山羊血清封閉30 min;以上各步驟間使用PBS洗滌3次，每次3 min。5-HT2CR抗體(1 ∶200) 室溫孵育1 h后孵育過夜(4 ℃);HRP標記山羊抗兔IgG孵育40 min(37 ℃);以上各步驟間使用PBS洗滌5次，每次5 min；DAB顯色，蘇木精染色18 s，流水沖洗，PBS 8 min，脫水、封片。應用光學顯微鏡觀察5-HT2CR分布及表達情況。

2 結果

2.1 各組小鼠血清甲狀腺激素及抗體水平HT組血清TGAb、 TPOAb水平高于CON組(P<0.05)，FT3、 FT4、 TSH水平差異無統計學意義。見表1。

表1 各組血清甲狀腺激素及抗體水平

與CON組比較:***P<0.001

2.2 甲狀腺HE染色CON組小鼠甲狀腺組織分布均勻，淋巴細胞浸潤少見。HT組小鼠甲狀腺濾泡排列紊亂伴部分破壞及淋巴細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組小鼠甲狀腺 HE×400

2.3 海馬5-HT表達水平與CON組相比，HT組小鼠海馬5-HT表達水平降低(P<0.01)。見圖2。

2.4 海馬5-HT2CR的表達與CON組相比，HT組小鼠海馬5-HT2CR的含量上調(P<0.001)。見圖3。

2.5 5-HT2CR在小鼠海馬各區表達及分布情況光鏡下觀察5-HT2CR免疫反應產物呈棕黃色顆粒。主要存在于海馬CA1、CA3區錐體細胞層和DG區顆粒細胞中。CA1區陽性顆粒主要分布椎體層，腔隙層、放射層顆粒相對較少。CA3區錐體細胞呈圓形或橢圓形，突起長。免疫陽性反應物在椎體層最密集、深染，呈小片或樹枝交叉狀分布，放射層和腔隙層分布較少，呈中空樹樣分布。DG區顆粒細胞排列緊密，5-HT2CR免疫陽性反應物主要分布在分子層外三分之二。光鏡下可見，HT組棕黃色面積大于且顏色深于CON組。見圖4。

圖2 各組小鼠5-HT表達

圖3 各組小鼠海馬5-HT2CR的表達

統計學分析小鼠海馬各區5-HT2CR免疫反應產物，結果顯示與CON組相比，HT組CA3區表達增加(P<0.01)。CA1區、DG區AOD值也有一定程度升高，但差異無統計學意義。見表2。

3 討論

本研究選用 NOD雌性小鼠，利用pTg結合弗氏完全佐劑尾部底部皮下注射、弗氏不完全佐劑二次免疫[6-7]，然后與雄鼠合籠，妊娠4.5 d造模完成。結果顯示，HT組小鼠血清 TGAb 和 TPOAb較CON組升高，甲狀腺病理切片呈甲狀腺濾泡部分破壞及淋巴細胞浸潤等形態學改變。FT3、FT4、TSH 與CON組相比差異無統計學意義，提示造模成功。

圖4 5-HT2CR免疫反應產物在小鼠海馬各區的表達 ×400

表2 各組小鼠海馬各區5-HT2CR表達水平

與 CON 組比較:**P<0.01

實驗通過ELISA檢測顯示在妊娠早期,HT組小鼠海馬組織中5-HT濃度低于CON組。課題組前期研究[8]發現橋本甲狀腺炎小鼠額葉內吲哚胺2,3-雙加氧酶1(indoleamine pyrrole-2, 3-dioxygenase, IDO)和5-HT轉運體上調。 IDO1是5-HT前體色氨酸的關鍵代謝酶，當IDO1激活時，可以耗竭局部組織的色氨酸，可能導致5-HT原料不足，進而減少5-HT合成。而5-HT轉運體表達上調則加速了該神經遞質的再攝取，推測橋本鼠額葉內5-HT減少與IDO1和5-HT轉運體表達的變化有關。Metaxas et al[9]研究發現阿爾茨海默癥可增加小膠質細胞活化，炎性因子釋放增加，誘導5-HT轉運體失調機制，干擾5 -羥色胺能神經傳遞，降低5-HT水平。Wixey et al[10]發現早產兒缺血缺氧后會導致神經炎癥，釋放細胞毒性物質，影響5-HT轉運體的表達，損傷5-HT能系統。結合以上研究推測在妊娠早期，HT小鼠海馬內5-HT濃度降低可能與IDO1和5-HT轉運體表達異常有關，具體機制有待進一步研究。

5-HT主要通過激活受體發揮作用。其中5-HT2CR是G蛋白偶聯受體，為突觸后受體，通過磷脂酶C激活第二信使傳遞信號引起下游細胞級聯反應[11]，主要分布在嚙齒動物海馬CA3區的錐體層，其次為CA1區[12]，與情緒反應密切相關。本實驗通過Western blot法測得HT組海馬組織5-HT2CR相對灰度值高于CON組。免疫組化法顯示5-HT2CR免疫陽性顆粒主要表達于海馬錐體細胞和顆粒細胞中。與CON相比，陽性顆粒在HT組小鼠CA3區椎體層表達最多，CA1區和DG區也有增高趨勢。說明在妊娠早期，HT小鼠海馬CA3區5-HT2CR的表達增加。Di et al[13]研究報道5-HT的缺失增加了5-HT2CR mRNA的表達，通過這種微調節機制以適應突觸活動的變化。Han et al[14]研究表明在帕金森患者中縫核5-HT2CR激活，對5-HT的負性調控作用增強, 引起5-HT含量降低，從而誘導焦慮行為發生。本實驗研究與之一致。