長鏈非編碼RNA PVT1通過miR-17-5p調控肝癌細胞增殖與遷移的機制研究

崔士猛，杜 漸，羅海峰，聞慶平，苗 壯，溫 超，吳 越

研究表明[1-2]長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)在多種癌癥類型的基因組改變、診斷、預后和治療預測中發揮著關鍵作用。到目前為止，lncRNA在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中已被證實在腫瘤細胞生長、化療敏感性、藥物誘導的細胞凋亡、腫瘤干細胞調控、治療結果預測和病毒性肝炎相關進展中發揮重要作用[3-5]。因此，lncRNA作為HCC發病機制的調控因子，被認為是潛在的癌癥治療靶點。

TCGA數據庫表明PVT1在HCC組織中表達明顯上調。課題組的細胞水平研究顯示，PVT1促進了HCC細胞增殖與遷移；通過生物信息學軟件預測提示PVT1存在與miR-17-5p靶向結合的位點；而miR-17-5p在HCC中常呈低表達并影響其發生發展。現通過實驗證明PVT1與miR-17-5p之間存在特異性調控關系，進而影響HCC細胞的增殖和遷移能力，為PVT1調控HCC細胞的分子機制奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料細胞株HepG2和Huh7購自上海中喬新舟公司；DMEM、胎牛血清及胰酶均購自美國Gibco公司。培養基通過DMEM添加10%胎牛血清進行配置，4 ℃保存不超過1周。細胞培養于37 ℃、5% CO2的培養箱中，每1～2 d換液1次，待細胞生長融合度達到80%～90%對細胞進行傳代。

RIPA裂解液、BCA試劑盒、TRIzol提取試劑均購自北京碧云天公司；cDNA逆轉錄試劑盒及SYBR Green RealTime PCR MasterMix購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒及Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；lncPVT1及siPVT1由上海吉瑪公司構建；miR-17-5p模擬物、抑制劑及陰性對照寡核苷酸由上海吉瑪基因設計及合成；雙熒光素報告基因試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細胞轉染 轉染前對細胞進行觀測，待細胞融合度達到50%～70%時對細胞進行si-PVT1及miRNA的轉染，NC為空載體，作為陰性對照。使用Lipofectamine 3000染試劑進行轉染實驗，根據說明書步驟將細胞放入培養箱37 ℃、5% CO2的環境培養6 h左右，隨后對細胞進行換液。提取RNA在轉染后24 h，蛋白提取在轉染后48～72 h。si-PVT1由吉瑪基因設計并構建：F:5-ATAGGATCCCGATGCTGGG-3, R:5-ATACGCTCGAGTCCGGAG-3。

1.2.2PCR定量 使用TRIzol對處理后的細胞進行總RNA提取，隨后加入氯仿進行12 000 r/min 離心20 min，獲取上清液，并加入異丙醇-20 ℃過夜，第2天進行12 000 r/min離心20 min，隨后使用75%乙醇進行清洗。NanoDrop檢測RNA的濃度及純度。隨后進行逆轉錄合成cDNA。PVT1-F:5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，PVT1-R:5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT -3′；miR-17-5p-F:5′-CGGCGGCAAAGTGCTTACAG-3′，miR-17-5p-R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH-F: 5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，GAPDH-R: 5′- ATGGCATGGACTGTGGTCAT -3′。

1.2.3雙熒光素酶實驗 將野生型Wt-PVT1和突變型Mut-PVT1序列插入到pGL4.74載體中，構建Luc-PVT1-WT和Luc-PVT1-MUT。所有的細胞24孔板過夜后，進行Luc-PVT1-WT/Luc-PVT1-MUT與miR-17-5p共轉染，共轉染時間12～24 h。采用雙熒光素酶報道系統檢測熒光素酶活性。

1.2.4CCK-8實驗 以2×103/孔的細胞量將細胞接種于96孔板中，設置3個復孔，置于恒溫培養箱中培養24 h，24 h后使用CCK-8試劑盒，按照說明書，每孔加入10 μl CCK-8溶液，培養箱孵育2 h，然后使用酶標儀檢測波長在450 nm處的吸光度 (optical density，OD) 值，計算細胞增殖/抑制率。細胞增殖/抑制率(%)=(對照組OD值-敲降組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%

1.2.5劃痕實驗 每株細胞待生長至約90%融合時，用移液槍頭進行劃痕，使用力度均勻，寬窄一致，分別對細胞進行0、24 h的觀測并記錄。

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件(SPSS, Inc.，Chicago, IL, USA)進行統計分析。采用獨立t檢驗分析兩組間的差異。組間數據比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA PVT1在HCC中呈高表達為了探究PVT1在HCC組織中的表達情況，首先通過TCGA數據庫-生信網站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)對PVT1在HCC中的表達進行評估，見圖1A。結果顯示在HCC中PVT1的表達明顯增高(P<0.05)。為探究PVT1在HCC細胞中的表達情況，使用L02細胞系作為對照，對Huh7、HepG2、Hep3B和Bel-7402細胞進行PVT1的檢測，見圖1B，結果顯示PVT1在后3者中表達增高(P<0.05)。

2.2 lncRNA PVT1促進肝癌細胞增殖和遷移選取Hep3B和Bel-7402細胞系進行功能評價實驗。首先通過轉染技術構建PVT1低表達細胞系，進行轉染效率的檢測。結果證實si-PVT1能夠顯著降低細胞中PVT1表達，見圖2A。與陰性對照組(si-NC)比較，CCK-8顯示PVT1敲低后細胞增殖能力顯著下降。見圖2B。并且敲低PVT1抑制了肝癌細胞遷移能力，見圖2C、D(P<0.05)。

2.3 PVT1能夠與miR-17-5p靶向結合通過生信網站STARBASE和miRcode對PVT1進行miRNA靶點預測，見圖3A。結果顯示miR-17-5p存在與PVT1靶向結合的位點(mimic-NC為陰性對照組，mimic-17-5p為實驗組)。為了證實預測位點的存在，使用熒光酶實驗在2種細胞系中進行驗證，見圖3B。結果提示Wt組miR-17-5p能夠與PVT1結合(P<0.05)。分析HCC細胞系中miR-17-5p的表達，結果顯示miR-17-5p在HCC細胞中表達明顯下降，見圖3C。另一方面，通過TCGA數據庫對PVT1與miR-17-5p的表達進行了相關性分析，見圖3D。結果表明PVT1與miR-17-5p表達呈現負相關(P<0.01)。以上實驗證明了PVT1能與miR-17-5p結合且二者表達呈負相關。

2.4 PVT1通過miR-17-5p影響肝癌細胞增殖和遷移能力為了驗證PVT1是通過miR-17-5p靶向結合從而影響HCC細胞的生物學功能。對敲低PVT1的細胞系進行miR-17-5p的檢測，見圖4A。結果提示敲低PVT1后導致miR-17-5p表達升高(P<0.05)。通過共轉染實驗驗證miR-17-5p抑制了PVT1對HCC細胞增殖的影響，見圖4B。劃痕實驗證明miR-17-5p抑制了PVT1誘導的HCC細胞遷移，見圖4C。上述結果表明PVT1對HCC細胞增殖和遷移能力的影響機制是通過miR-17-5p發揮作用。

圖1 lncRNA PVT1在肝癌組織和細胞中高表達

圖2 長鏈非編碼RNA PVT1影響肝癌細胞增殖和遷移

A：PVT1的轉染效率；B：細胞的生存能力；C：敲低PVT1后Hep3B細胞的遷移能力；D：敲低PVT1后Bel-7402細胞的遷移能力；與si-NC比較:**P<0.05，*P<0.05

圖3 PVT1與miR-17-5p靶向結合

A：Targetscan 預測結合位點；B：Hep3B細胞系相對熒光素酶活性；C：Bel-7402細胞系相對熒光素酶活性；D: miR-17-5p相對表達量；E：PVT1與miR-17-5p表達的相關性(Spearmen-correction：0.4993，p-value：6.547e-24，Sample：n=357)；與PVT1Wt mimic-NC比較：*P<0.05; 與PVT1Mut mimic-NC比較：#P<0.05；與L02比較：△P<0.05

圖4 PVT1通過miR-17-5p促進HCC細胞增殖和遷移

A：miR-17-5p轉染效率； B：CCK - 8測定細胞生存能力；C：細胞遷移能力的測定；a：inhibitor-NC；b：siPVT1+inhibitor-NC；c：inhibitor；d：inhibitor+siPVT1；與mimic-NC比較：**P<0.01；與inhibitor-NC組比較：#P<0.05；與inhibitor組比較：△P<0.05

3 討論

研究[6-7]發現PVT1能夠參與腫瘤細胞多種生物學功能，包括影響細胞增殖、侵襲和遷移、代謝等過程。本實驗探究了PVT1對HCC細胞增殖及遷移能力的影響。近年來，不斷有研究證實ceRNA是lncRNA發揮調控腫瘤細胞功能的具有重要意義的調控機制。lncRNA可通過靶向結合某些miRNA，并間接的抑制miRNA對其靶基因的調控作用，從而實現了對腫瘤發生、發展的影響。有研究[8]發現，PVT1能夠作為輔助腫瘤診斷或判斷患者預后的標志物。本研究通過TCGA數據庫分析了PVT1在HCC組織中的表達情況，并在細胞系中證實了PVT1在肝癌細胞中的高表達趨勢。

miRNAs被認為是各種腫瘤的獨立調控因子，在ceRNA機制上也發揮著特定的作用。一般認為miRNA是lncRNA調控腫瘤發生的靶基因，通過與lncRNAs相互作用或靶向mRNA參與許多人類腫瘤的生物學過程。miR-17-5p參與肝癌的多種生物學效應且能在很大程度上提高癌細胞生長[7]。除了miR-17-5p外，其他miRNA例如miR-181a-5p也與癌細胞的生命活動息息相關[9]。lncRNA PVT1能否作為ceRNA參與對miR-17-5p表達的調控需要進一步驗證。

本研究證實 PVT1能夠與miR-17-5p靶向結合，并通過共轉染實驗驗證了lncRNA PVT1對肝癌細胞的影響是通過抑制miR-17-5p從而發揮作用。為了探尋PVT1在肝癌細胞中的潛在分子機制，通過熒光素酶實驗證實了數據庫的預測結果。實驗結果表明PVT1可以與miR-17-5p靶向結合。進一步實驗顯示PVT1通過阻斷miR-17-5p的表達，正向調控肝癌細胞增殖和能力。但其靶基因和下游的目標蛋白都是哪些分子，這些問題有待進一步研究。