過表達ADAM10通過Notch/Akt信號通路抑制急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡

張 浩，左和平，劉澤巖，丁旵東

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是臨床上較為常見的、致死率較高的心血管疾病，冠狀動脈急性或持續性缺血缺氧造成的心肌細胞死亡是AMI早期的重要事件，也是引起心肌重構及心力衰竭的重要因素之一[1]。因而通過尋找有效分子靶點來阻斷心肌細胞凋亡，已逐漸成為研究AMI損傷修復的熱點領域。解整合素金屬蛋白酶10(a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)是一種錨定于細胞膜表面的I型跨膜蛋白，參與細胞黏附、融合以及膜蛋白脫落和蛋白水解等多種生物學過程[2]。有研究[3]顯示，ADAM10能夠水解Notch蛋白膜外段受體，該過程是Notch通路活化的最關鍵步驟。而Notch信號通路不僅在哺乳動物胚胎期心臟發育中發揮重要作用，還參與哺乳動物成年后各類心臟疾病的調控[4]，包括AMI。尤其在心肌缺血時，激活Notch信號通路可通過誘導血管生成、抑制心肌細胞凋亡，發揮改善心肌缺血再灌注損傷的作用[5]。因而據此推測ADAM10有可能通過Notch途徑參與AMI所致心肌細胞凋亡的調控，但目前鮮有報道。現通過心肌原位注射ADAM10腺病毒，觀察ADAM10過表達對AMI大鼠心肌細胞凋亡的影響，并探討其作用機制是否是經激活Notch/Akt信號通路實現，以期為AMI的治療提供新的潛在分子靶點。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑6～7周齡健康清潔級雄性SD大鼠40只，體質量250～300 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(湘)2014-0010。所有大鼠均在(23±2)℃，相對濕度40%～70%，12/12 h光照周期條件下飼養，并自由飲食和攝水。ADAM10過表達質粒(GV345)構建及其腺病毒(2×1010PFU/ml)包裝、濃縮和純化均由上海吉凱基因化學技術有限公司完成；TRIzol試劑購自美國ThermoFisher Scientific公司；BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3, 5-triphenyl tetrazolium chloride，TCC)染色試劑購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗ADAM10多克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司；兔抗Akt多克隆抗體、兔抗磷酸化Akt(Ser473)單克隆抗體、兔抗Cleaved-caspase-3多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體、兔抗Hes家族bHLH轉錄因子1(Hes1)均購自美國CST公司；兔抗Notch受體1(Notch1)單克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1AMI模型建立及分組處理 40只大鼠被隨機均分為假手術(sham)組、AMI組、空載腺病毒(Ad-NC)組和ADAM10腺病毒(Ad-ADAM10)組。除sham組外，其余各組大鼠均采用冠狀動脈左前降支結扎術[6]建立AMI模型，而sham組大鼠僅采取冠狀動脈左前降支穿線而不結扎。若觀察到結扎局部下方或左心室變白，心率較為緩慢，并且Ⅱ導聯心電圖ST段抬高呈弓背向上型，表明AMI模型制備成功[7]。隨后，AMI組、Ad-NC組和Ad-ADAM10組于心肌梗死區域選擇3個位點分別注射10 μl生理鹽水、空載腺病毒(2×1010PFU/ml)和ADAM10腺病毒(2×1010PFU/ml)，sham組于相同區域注射等量生理鹽水。術后72 h大鼠全部存活并處死大鼠，取心臟于-80℃保存備用。

1.2.2超聲心動圖評估心臟功能 術后72 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，對大鼠進行心臟超聲檢測，記錄左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室縮短分數(left ventricular shortening score，LVFS)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)和左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter，LVDs)。

1.2.3RT-PCR檢測心肌組織中ADAM10mRNA表達水平 取各組大鼠心臟梗死邊緣區域心肌組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，分光光度計測量RNA純度。取2 μg RNA逆轉錄成cDNA，隨后以cDNA為模板，按照SYBR Green qPCR Mix說明書操作進行PCR擴增。引物序列：ADAM10上游引物為5’-AAGAAGCTT CCCACAAGGCA-3’，下游引物為5’-TGTGTACGCAGAGTATCTAACTGG-3’； GAPDH上游引物為5’-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3’，下游引物為5’-ATCC GTTGACTCCGACCTTC-3’。PCR條件：95 ℃預變性15 min；95℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算ADAM10 mRNA相對表達量。

1.2.4TCC染色評估心肌梗死面積 取凍存心臟組織，在心尖到結扎點間進行冰凍切片，厚度4 μm，將切片置于1%的TCC染液中，于水浴箱中37 ℃避光孵育15 min，正常心肌區域被染成紅色，梗死區域被染成白色，染色后即可拍照觀察。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算心肌梗死面積所占百分比，梗死面積百分比=白色區域面積/切面總面積×100%。

1.2.5TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡 取凍存的結扎線以下部分左心室心肌，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟包埋后切片，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，光鏡下拍照觀察。凋亡細胞的細胞核被染成棕褐色，每張切片隨機選取5個視野，統計陽性細胞和總細胞數目，凋亡率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.6Western blot檢測相關蛋白表達水平 取凍存的結扎線以下部分左心室心肌組織，加入適量RIPA裂解液后冰上研磨20 min，4 ℃下12 000 r/min 離心25 min，收集上清液，采用BCA法進行蛋白定量。取20 μg蛋白進行10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，再將蛋白轉移PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入ADAM10(1 ∶1 000)、Cleaced-caspase-3(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Notch1(1 ∶500)、Hes1(1 ∶500)、Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(ser473)(1 ∶1 500)和GAPDH(1 ∶2 000)等一抗，4 ℃孵育過夜。次日，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗小鼠IgG二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育1 h，洗滌后加入ECL超敏發光液，顯影。以目的條帶灰度值與內參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 過表達ADAM10對大鼠心肌組織中ADAM10表達的影響如圖1所示，與sham組比較，AMI組大鼠心肌組織中ADAM10 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)；與AMI組比較，Ad-ADAM10組大鼠心肌組織中ADAM10 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)，而Ad-NC組與AMI比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 過表達ADAM10對大鼠心臟功能及心肌梗死的影響如表1所示，與sham組比較，AMI組大鼠心臟功能參數值LVEF和LVFS降低(P<0.05)，LVDd和LVDs升高(P<0.05)；與AMI組比較，Ad-ADAM10組大鼠心臟功能參數值LVEF和LVFS升高(P<0.05)，LVDd和LVDs降低(P<0.05)，而Ad-NC組與AMI組比較差異無統計學意義(P>0.05)。此外，sham組大鼠未見心肌梗死，與AMI組比較，Ad-ADAM10組大鼠心肌梗死面積減小(P<0.05)，而Ad-NC組與AMI組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織中ADAM10蛋白及mRNA的表達

A：ADAM10 mRNA；B：ADAM10 蛋白；1：sham組；2：AMI組；3：Ad-NC組；4：Ad-ADAM10組；與sham組比較：*P<0.05；與AMI組比較：###P<0.001

2.3 過表達ADAM10對大鼠心肌組織細胞凋亡的影響如圖2所示，sham組心肌TUNEL染色切片呈現的棕褐色陽性染色細胞少，凋亡率低；與sham組比較，AMI組切片呈現的陽性染色細胞增多，細胞凋亡率升高(P<0.05)；與AMI組比較，Ad-ADAM10組切片呈現的陽性染色細胞又減少，細胞凋亡率降低(P<0.05)，而Ad-NC組與AMI組比較差異無統計學意義(P>0.05)。同時，與sham組比較，AMI組心肌組織凋亡蛋白Cleaved-caspase-3和Bax表達水平增加(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低(P<0.05)；而與AMI組比較，Ad-ADAM10組Cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達水平又降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平又升高(P<0.05)，且Ad-NC組與AMI組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖2 TUNEL染色 ×100

1：sham組；2：AMI組； 3：Ad-NC組；4：Ad-ADAM10組；與sham組比較：**P<0.01; 與AMI組比較：#P<0.05

表1 各組大鼠心臟功能及心肌梗死面積比較

與sham組比較：*P<0.05，**P<0.01；與AMI組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖3 各組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平

1：sham組；2：AMI組；3：Ad-NC組；4：Ad-ADAM10組；與sham組比較：**P<0.01,***P<0.001；與AMI組比較：##P<0.01,###P<0.001

2.4 過表達ADAM10對大鼠心肌組織Notch/Akt信號通路的影響如圖4所示，與sham組比較，AMI組大鼠心肌組織中Notch1、Hes1蛋白表達水平以及Akt磷酸化水平降低(P<0.05)；與AMI組比較，Ad-ADAM10組Notch1、Hes1蛋白表達水平以及Akt磷酸化水平升高(P<0.05)，而Ad-NC組與AMI組比較差異無統計學意義。

3 討論

ADAM10是一種具有多個功能結構域的跨膜蛋白，其不僅參與其他膜蛋白的水解過程，而且還參與細胞黏附及各種細胞信號的轉導過程，在正常生理以及病理狀態下均發揮重要作用。ADAM10在脊髓動物心臟發育及血管形成過程中也起到關鍵作用。例如，Farber et al[8]研究顯示，ADAM10通過Notch通路調控小鼠冠狀動脈的分化，其缺失將導致冠狀動脈分化的缺陷。Li et al[9]報道稱，通過阻斷ADAM10水解N-cadherin蛋白可有效改善擴張型心肌病大鼠的心室重構。王博石 等[10]研究證實，ADAM10基因突變可導致人類先天性心臟缺陷。此外，ADAM10是Notch活化的關鍵調控因子[3]，而Notch信號元件的突變或缺失也會導致心臟瓣膜畸形、心臟心室發育不全、心室分隔障礙等眾多心臟疾病[11]。因此，ADAM10與多種心臟疾病的發生發展密切相關，然而ADAM10是否經Notch信號通路參與AMI調控，目前還未曾報道。本研究顯示，心肌原位注射ADAM10過表達腺病毒能夠抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡，改善心功能，并激活Notch/Akt信號通路，提示ADAM10可能成為治療AMI的一個潛在靶點。

1：sham組；2：AMI組；3：Ad-NC組；4：Ad-ADAM10組；與sham組比較：*P<0.05；與AMI組比較：###P<0.001

AMI是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起心肌壞死的過程。本研究采用冠狀動脈左前降支結扎術構建AMI模型，能夠較好的再現AMI的發病過程，使研究更貼近實際病理條件，也使研究結果更加可信。此外，AMI常伴有進行性心電圖變化及心功能改變，因此心臟超聲檢查是評價AMI時心功能的重要輔助手段。本研究結果顯示，與sham組比較，AMI組大鼠LVEF和LVFS值降低，LVDd和LVDs值升高，并且AMI組大鼠出現較大面積的心肌梗死和較高心肌細胞凋亡率，表現出明顯的心功能下降及嚴重的心肌梗死和心肌細胞凋亡的現象。為了進一步探討ADAM10在心肌梗死過程中的作用，本研究通過心肌組織原位注射ADAM10過表達腺病毒以提高心肌組織中ADAM10表達水平，結果表明ADAM10過表達能提高AMI大鼠心功能LVEF和LVFS值、降低LVDd和LVDs值，并降低心肌梗死面積和心肌細胞凋亡率，提示ADAM10過表達能改善AMI大鼠心功能，抑制心肌細胞凋亡。然而，李小鷗 等[12]研究發現敲低ADAM10表達能改善阿霉素誘導的擴張型心肌病大鼠心功能，這可能是由于擴張型心肌病與AMI病理機制不一致以及ADAM10行使功能不同所導致。

心肌細胞凋亡是AMI心肌梗死區最重要的病理特征，而細胞凋亡是一種受多種基因調控的程序性死亡過程。在細胞凋亡早期，Bax可介導線粒體內外膜間隙中凋亡啟動因子Cyt C釋放至胞質，激活Caspase-9啟動Caspase級聯反應，最終由Caspase-3執行凋亡作用，而抗凋亡蛋白Bcl-2可與Bax結合成二聚體抑制Bax行使功能[13]。本研究結果顯示，與sham組比較，AMI組大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3水平及Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白水平降低，說明AMI大鼠心肌細胞凋亡水平較高。然而，ADAM10過表達可降低Cleaved-caspase-3和Bax蛋白水平，提高Bcl-2蛋白表達水平，說明ADAM10過表達可抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡。

有研究[14]顯示，在胚胎期未成熟的心肌細胞中Notch1被激活以促進其發育和增殖，然而在出生后成熟的心肌細胞中Notch1被下調。同時，Zhou et al[15]研究顯示，過表達Notch1能夠促進缺氧復氧條件下心肌細胞的存活。此外，Notch1還可以通過激活下游Akt途徑抑制心肌細胞凋亡[16]。鑒于是Notch活化的關鍵調控因子，據此推測ADAM10過表達有可能通過激活Notch/Akt信號通路抑制AMI心肌細胞凋亡。結果顯示，與AMI組比較，ADAM10過表達也可提高Notch1、Hes1蛋白表達水平以及Akt磷酸化水平，說明ADAM10過表達是通過激活心肌組織中Notch/Akt信號通路來抑制心肌細胞凋亡，從而改善AMI大鼠心功能。

綜上所述，本研究結果證實過表達ADAM10能夠通過激活Notch/Akt信號通路抑制心肌細胞凋亡，改善AMI大鼠心功能。因而，ADAM10有可能為AMI的靶向治療提供新的線索和論據。