牙齦卟啉單胞菌蛋白酶Ltp1的表達、純化及酶學性質研究

顧前程，夏 榮，孔文文

牙周病是人類口腔的常見病和多發病。牙菌斑生物膜的形成和堆積是牙周病的直接原因，菌斑微生物可通過自身代謝產物引起組織破壞；也可通過刺激或改變宿主的自身免疫反應間接危害宿主[1]。牙齦卟啉單胞菌是目前公認的牙周致病菌[2]。其致病性主要體現在：表面結構和蛋白酶直接起著黏聚分子的作用；可產生多種胞外蛋白酶、內毒素、磷酸酶，均可對牙周組織產生破壞作用[3]。而酪氨酸蛋白酶(tyrosine protein phosphatase, PTPs)正是這些毒力因子中的一種。Maeda et al[4]發現，在牙齦卟啉單胞菌基因組中，存在PG1641基因，推測它表達了一種低分子量Ltp1。關于該蛋白酶的酶學性質研究，Maeda et al[4]采用了突變法表達此蛋白；并以孔雀石綠檢測法，證實其為酪氨酸磷酸酶蛋白，同時檢測不同金屬離子對酶活性質的影響，但未對目的蛋白的反應溫度和相應pH做相應檢測。該研究通過生物學技術對目的基因進行直接合成，并以原核表達系統表達出數量較多、純度較高的目的蛋白，簡化步驟方法，同時對其進行活性檢測及晶體學初篩，為后續蛋白結構研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器大腸桿菌BL21(DE3)(上海Invitrogen)；pET29a載體改造后的p29載體(北京Novagen)；質粒抽提試劑盒 (美國Axygen)；PCR回收試劑盒 (美國Axygen)。引物與目的基因：PCR擴增引物、目的基因PG1641由通用生物系統(安徽)有限公司合成 ；序列測定：上海生物工程技術服務公司、通用生物系統(安徽)有限公司。化學試劑：克隆位點(5’ NdeI和3’Xhol)、Luria-Bertani(LB)培養基、瓊脂、卡那霉素、異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)(美國Merck公司)、HEPES緩沖液(pH7.4)、1 mol/L 咪唑、5 mol/L NaCl、Buffer：50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl 、蛋白純化洗脫液：50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl 40 ml、20 A:20 mm咪唑30 ml(5 mol/L咪唑120 μl加buffer至30 ml)、20B:20 mm咪唑30ml(5 mol/L咪唑120 μl加buffer至30 ml)、300 mm咪唑6 ml(5 mol/L咪唑360 μl buffer 5640 μl)、小鼠抗His標簽單抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、ECL底物發光顯影定影試劑盒(以上實驗材料均來自美國Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1基因合成 參考GeneBank上PG1641目的基因序列(編號為：NC_002950.2)，對PG1641目的基因序列分析后進行密碼子優化，使其適合于原核表達系統，交于通用生物系統(安徽)有限公司合成(合同編號G0131961)，將PG1641構建于pET19-b載體上，克隆位點分別是NdeI-XhoI。

1.2.2LTP1蛋白重組質粒的構建 將合成的基因載體，用CloneExpress同源重組方法重新構建質粒表達系統pET29-PG1641-His。在設計引物時要設計目的基因以及載體線性化的引物，目的基因的正反向引物要和載體的線性化引物有15～20 bp的同源序列，這樣可以在重組酶ExnaseⅡ的催化下發生同源重組。根據Ltp1 PG1641(513 bp)基因序列設計上下游引物，上游引物PG1641-S：5’-AGGAGATATACATATGAAGCCGCATAAAATTCTGTT-3’；下游引物PG1641-A：5’- GGTGGTGGTGCTCGAGATCGCAGGCGCTCAGACTAC-3’。

1.2.3重組質粒載體的擴增與鑒定 ① 將同源重組法構建的pET29-PG1641-His載體，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態中，將轉化后產物均勻涂在含卡那霉素抗性的LB固體培養基上，置于37 ℃恒溫培養箱過夜。② 篩選陽性克隆并進行菌液PCR，同時將菌液做瓊脂糖電泳檢測，并送測序(上海生工生物有限公司)，在NCBI上以Blast軟件進行序列對比和分析，將正確結果的菌液進行質粒返還，將回收的質粒進行瓊脂糖電泳。

1.2.4Ltp1蛋白的表達與純化

1.2.4.1Ltp1的轉化與表達 將返還驗證后的重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態中，之后將轉化的菌液加入LB液體培養基中(卡那霉素抗性)，37 ℃搖床培養至吸光度(optical density，OD)600 nm: 0.6～0.8時，加入IPTG，16 ℃搖床上誘導過夜表達。Beckman離心機(4 000 r/min，15 min)收菌。每罐菌體以20 ml 20 mm Tris-HCl pH7.5 150 mm NaCl 重懸，分裝至10個15 ml試管中，-30 ℃冰箱保存。

1.2.4.2菌液破碎與制樣 取上述菌液，化凍后倒出半管菌液至50 ml小燒杯中，加入50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl至30 ml。將小燒杯放置冰上，進行冰浴超聲破碎(功率42%，總時間30 min,破2 s,停2 s)，破碎后菌液離心(12 000 r/min, 30 min)，沉淀用buffer重懸，將上清液和沉淀分別制樣。

1.2.4.3Ltp1鎳柱層析粗純化 將上清液樣品進行鎳離子親和層析：先用10倍柱體積50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl沖洗平衡鎳柱，然后加入上清液樣品，設置流速5～6 s 1滴，流完后先用40 ml上述buffer流速設置2～3 s 1滴，之后分別用2管30 ml 20 mm咪唑洗脫雜蛋白流速2～3 s 1滴，最終用6 ml 300 mm咪唑洗脫下目的蛋白(流速5～6 s 1滴)，并且分別制樣，和上述上清液、沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4.4Ltp1分子篩細純化 將300 mm咪唑洗脫下的目的蛋白分裝在6個1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心10 min，之后用分子篩層析進一步分離細純化。先用配置好且已經超聲除氣好的buffer(50 mm HEPES pH7.4 150 mm NaCl )沖洗S75凝膠層析柱，平衡柱子，流出速度為1.0 ml/min，柱壓為0.7 MPa，沖洗體積為120～140 ml。然后將6 ml 150 mm咪唑洗脫下且離心好的蛋白質樣品通過注射器上樣，設置流速1.0 ml/min，柱壓0.7 MPa，每管接樣體積1.4 ml，紫外燈280 nm進行檢測。大約當沖洗體積是70～90 ml時紫外OD值發生變化，軟件上出現一個尖銳峰，收集此峰范圍內EP管所接樣品并標記。對所收集樣品紫外分光光度儀測濃度并分別制樣跑電泳檢測。

1.2.5Western blot鑒定重組蛋白 將上述細純化收集的目的蛋白樣品加入濃縮管(美國Millipore)，截留分子量大小10 ku蛋白質，4 ℃、3 200 r/min 離心機離心10 min。紫外分光光度儀測OD值，直至蛋白質濃度濃縮達10 mg/ml以上。采用Western blot法對濃縮樣品進行檢測：一抗為小鼠抗His標簽單抗，二抗為稀釋為1 ∶3 000的HRP標記的羊抗小鼠IgG，將細純化濃縮后的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳，用PVDF膜轉模，脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，洗3次；加入小鼠抗His標簽單抗(一抗)(1 ∶2 000)，室溫結合1 h，洗膜5次；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠 IgG(二抗)(1 ∶3 000)，室溫結合45 min，洗5次，ECL底物發光顯影定影試劑盒顯色，使用X線曝光分析結果。

1.3 Ltp1酶學研究

1.3.1OD變化 室溫下，以對硝基苯磷酸二鈉為顯色底物溶液，與純化所得目的蛋白反應，以NaOH終止反應，使用DU800監測A405 nm OD變化[5]。實驗組為底物對硝基苯磷酸鹽(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)溶液同時加入PG1641目的蛋白參與反應，空白組為單獨底物p-NPP溶液不加目的蛋白PG1641。

1.3.2不同反應溫度對蛋白活性影響 將1.3.1中溫度分別設為37、50、75 ℃，加入目的蛋白，其他條件不變，進行顯色反應。

1.3.3不同pH對蛋白活性影響 配置不同pH反應液，pH分別為5.0、6.0、7.4、9.0，加入目的蛋白，其他條件不變進行顯色反應。

1.3.4酶活測定 在室溫下，50 mm HEPES 150 mm NaCl pH7.4條件下，將細純化目的蛋白與不同濃度對p-NPP反應，測OD值，最后應用雙倒數作圖計算Km和Vmax值。

2 結果

2.1 Ltp1表達載體的構建圖1為瓊脂糖電泳結果：從NCBI上得知PG1641目的基因為513 bp,瓊脂糖電泳結果與目的基因大小基本一致，在500多bp左右；圖2顯示，質粒回收后瓊脂糖電泳結果也與實際結果一致。圖3以生物學信息軟件ExPAsy軟件生物學信息軟件分析知Ltp1蛋白PI值約為4.99，理論相對分子量約為18.75 ku。

圖1 p29-PG1641菌液PCR后DNA瓊脂糖電泳

M：DNA Marker；1、2、3、4、5、6：均是菌液PCR后目的基因PG1641

圖2 質?；厥蘸蟓傊请娪?/p>

M：DNA Marker；1、2、3、4：回收的PG1641目的基因

圖3 ExPASy軟件分析結果

2.2 Ltp1蛋白的大量表達將構建成功的原核表達載體p29-PG1641-His轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，經過IPTG誘導表達，收菌、離心破碎、純化后，SDS-PAGE結果顯示：與理論值18.75 ku大小基本符合，且粗純化和細純化后在上清液和300 mm咪唑洗脫液中均存在目的蛋白Ltp1。圖4為鎳柱親和層析粗純化SDS-PAGE結果：可以觀察到上清液和300 mm咪唑洗脫液條帶范圍大約在18.4～25.0 ku之間；圖5為分子篩細純化樣品SDS-PAGE結果：可以觀察到管數51、53、55、57、61、63、65均有目的蛋白。

圖4 鎳柱層析樣品粗純化SDS-PAGE

M：蛋白Marker；1：上清液；2：流穿；3：buffer；4：20 mm咪唑洗脫液；5：20:mm咪唑洗脫液；6：300 mm咪唑洗脫液

圖5 分子篩尖峰下細純化樣品SDS-PAGE

M：蛋白Marker；51、53、55、57、59、61、63、65：分別為分子篩A280尖峰下對應樣品管數

2.3 Western blot測定將分子篩細純化樣品濃縮后的目的蛋白進行Western blot分析，顯色后在PVDF膜上出現單一條帶(圖6)，表明表達的目的蛋白確實是帶有His標簽的Ltp1目的蛋白。

M：蛋白Marker(Easy-see marker)；1、2、3、4：均是分子篩樣品濃縮后PG1641蛋白

2.4 Ltp1酶學檢測結果Ltp1可催化p-NPP產生黃色產物p-NP。純化后所得目的蛋白具有典型磷酸酶活性(圖7)，且在pH 5.0～6.0均具有較高催化活性(圖8)，隨著pH升高，活性逐漸降低；37～50 ℃時，活性最高(圖9)。

圖7 酶活反應

圖8 pH檢測

圖9 溫度檢測

2.5 酶活結果在不同濃度p-NPP底物條件下，與重組目的蛋白反應，測定其初速度(1/V)，以1/V和1/S做雙倒數圖，求得重組蛋白的Km和Vmax分別為：70.4 μmol和51.1 μmol/(L·min)。

圖10 米氏常數Km和最大反應速度Vmax測定1/V：反應速度倒數；1/S：底物濃度倒數

3 討論

牙齦卟啉單胞菌是口腔中一種革蘭陰性厭氧菌，與齒垢密螺旋體、福賽坦氏菌共稱為“紅色復合體”，和晚期牙周病變密切相關[6]。具有對牙周組織高度破壞性，這主要歸因于其特有的毒力因子庫。而Ltp1正是毒力因子庫的多功能調節劑：首先這種病原體不產生鐵載體, 相反，它以特定的菌毛蛋白,促進Ltp1釋放，以此來加速血紅素的攝取，最終調節胞外多糖合成[7]；Ltp1還可以促進牙齦素(RgpA、RgpB或Kgp)等蛋白酶的產生，這些蛋白酶為糖酵解提供了肽底物，用于降解牙齦纖維和宿主產生的免疫效應分子,并且牙齦素已被公認為是生物體的主要毒力決定因素[8-9]；Ltp1還可參與約束單種菌斑生物膜和異型菌斑微生物膜的累積，例如在牙齦卟啉單胞菌和戈登鏈球菌異型微生物社區中，第一步就是由2個不同的黏附素受體介導的共價黏附作用[10]；除此之外，Ltp1還可干擾細菌種間AI-2信號的傳導，主要是通過負調節LuxS的轉錄，從而使細菌黏附受到干擾[11]。

本研究將牙齦卟啉單胞菌目的基因PG1641重組至帶有His標簽的pET29載體上，利用大腸桿菌BL21進行誘導表達。SDS-PAGE電泳檢測到相對分子量約為18.75 ku的目的蛋白，Western blot鑒定了該重組蛋白。通過與其底物p-NPP反應得知其酶活Km和Vmax分別為70.4 μmol、51.1 μmol/(L·min)，在pH 5.0～6.0和37～50 ℃具有較高活性，后續實驗將對其進行進一步優化，以期獲得純度更高且不含標簽的的目的蛋白。為下一步晶體學初篩，晶體條件的探索奠定基礎，這樣就可以從結構生物學角度明晰其致病機理，也可為牙周炎的免疫治療、靶向藥物研究提供方向。