熱加工條件對牛血清白蛋白-葡萄糖糖基化體系抗氧化活性的影響

李 軍，涂宗財,2,*，張 露，羅 娟

（1.江西師范大學 國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌 330022；2. 南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

糖基化反應又稱為美拉德反應，主要是指氨基化合物（蛋白質、氨基酸）與羰基化合物（還原糖、醛）之間發生的非酶褐變反應[1-2]。在食品加工過程中，糖基化反應會產生還原酮、雜環化合物和類黑精等一系列具有一定抗氧化活性的糖基化產物[3-5]，從而提高食品的抗氧化能力。Chen Kun等[6]以木糖和牛酪蛋白水解產物為原料制備美拉德反應產物，在一定的反應時間內，其抗氧化活性隨著反應時間的延長而增大；Yan Fang等[7]優化制備殼寡糖-甘氨酸體系的美拉德反應產物，經研究發現其處理的果汁比殼寡糖和甘氨酸混合處理的果汁具有更高的抗氧化能力；Chen Kangni等[8]利用魚鱗明膠水解物和3 種糖類進行反應，發現核糖-魚鱗明膠水解物復合物體系具有最高的抗氧化能力，可用作功能性食品配料中的抗氧化劑；Yilmaz等[9]通過測定組氨酸和葡萄糖體系中抗氧化性的研究發現，美拉德反應產物的抗氧化性隨著時間的延長呈先增加后降低的趨勢。目前的研究大多是評價蛋白質糖基化產物的抗氧化活性，對于通過控制反應條件來調控其抗氧化活性的研究較少。

在高蛋白、高糖類食品的加工過程中，一般使用的原料都含有豐富的蛋白質（如面包、肉質食品等），為了提高產品的品質或延長商品的貨架期，通常會加入一定量的合成抗氧化劑（如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯[10]），雖然它們能有效地清除自由基、減緩氧化反應，防止食品酸敗，但其安全系數較低，對人體可能存在致癌的風險[11-12]。糖基化產物是食品熱加工自身產生的一類物質，可被視為天然物質，研究也證實某些糖基化產物具有較強的抗氧化活性，其活性甚至可以和合成抗氧化劑相媲美[13-15]。所以，越來越多的學者認為通過控制熱處理工藝使食品產生具有抗氧化性的產物，可作為提高食品安全性的一種潛在方法。本課題組前期研究發現牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）-葡萄糖體系在不同溫度、時間熱處理下可發生糖基化反應，產生果糖胺、羰基化合物、5-羥甲基糠醛和丙烯酰胺等糖基化產物[16]，但是不同熱處理條件對體系糖基化產物抗氧化活性尚不清晰。因此，本實驗以BSA-葡萄糖體系為糖基化反應模型，通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力和還原能力實驗評價反應時間和溫度的變化對糖基化產物抗氧化能力的影響，從而為制備高抗氧化性蛋白質糖基化產物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BSA、葡萄糖、DPPH（均為分析純） 美國Sigma公司；ABTS（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍G-250、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、鐵氰化鉀（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他所需試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FA1104N型電子分析天平 上海丙林電子科技有限公司；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；LGJ-1D-80型冷凍干燥機 北京亞泰科隆儀器技術有限公司；Synergy H1型酶標儀 美國Bio Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

參照Liu Yan等[17]的干熱法制備BSA-葡萄糖體系糖基化樣品。將BSA溶于20 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配成25 mg/mL的溶液，按照葡萄糖與蛋白質量比為1∶1的比例向BSA溶液中加入葡萄糖，混勻，冷凍干燥。將凍干的粉末置于恒溫烘箱中進行糖基化反應，反應條件為55 ℃分別反應6、12、24、36、48、72 h，或分別于50、60、70、80、90、100 ℃下反應12 h。烘箱內放置飽和KI溶液以維持相對濕度為65%。待糖基化反應結束后，將樣品置于冰水浴中終止反應，并置于4 ℃冰箱中保存待測。

1.3.2 可溶性蛋白質量濃度的測定

采用考馬斯亮藍法測定樣品中的可溶性蛋白質量濃度[18]。取50 μL稀釋到適宜質量濃度的樣品溶液與200 μL 0.1 mg/mL考馬斯亮藍G-250溶液于96 孔酶標板中混勻，50 μL的蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，室溫混合靜置1 min后于595 nm波長處測定OD值。以不同質量濃度（20～200 μg/mL）的BSA標準溶液作標準曲線，根據標準曲線計算樣品溶液中的可溶性蛋白質量濃度。實驗重復3 次。

1.3.3 自由氨基質量濃度的測定

采用OPA法測定樣品中的自由氨基質量濃度[19]。稱取80 mg OPA溶解于2 mL甲醇中，分別加入5 mL 20 g/100 mL的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液、50 mL 0.1 mol/L硼砂溶液和200 μL β-巰基乙醇，蒸餾水定容至100 mL配成OPA溶液。取200 μL稀釋到適宜質量濃度的樣品溶液加入到4 mL OPA溶液中混勻，以200 μL蒸餾水代替樣品作為空白對照，避光反應2 min后于340 nm波長處測定吸光度。以不同質量濃度（0.05～1.00 mg/mL）的賴氨酸標準溶液作標準曲線，利用標準曲線計算樣品中自由氨基的質量濃度。實驗重復3 次。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

采用DPPH自由基清除能力實驗比較樣品之間的自由基清除能力[7]。分別取100 μL 10 mg/mL樣品溶液與100 μL 0.15 mmol/L DPPH自由基溶液（甲醇配制）于96 孔酶標板上混勻，室溫下避光反應30 min后于517 nm波長處測定吸光度（Ai）。以100 μL甲醇代替樣品的反應體系為控制組（Ac），以100 μL PBS（0.2 mol/L、pH 7.4）代替DPPH自由基溶液的反應體系為樣品空白組（Aj），分別以100 μL甲醇和PBS代替樣品和DPPH自由基溶液的反應體系為空白組（Ab）。采用兩倍稀釋法進行實驗，以槲皮素為陽性對照，結果用抑制率表示。實驗重復3 次，采用Origin 8.6軟件中的多項擬合計算樣品清除自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）/（mg/mL）。DPPH自由基清除能力按下式計算。

1.3.5 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

采用ABTS陽離子自由基清除能力實驗來評價樣品中的總抗氧化能力[20]。稱取38.4 mg ABTS和6.623 mg過硫酸鉀混合，蒸餾水溶解后并定容至10 mL配成ABTS母液。室溫避光反應12～16 h后用PBS稀釋ABTS母液至734 nm波長處吸光度為0.70±0.02左右。分別移取50 μL 5 mg/mL樣品溶液與150 μL ABTS溶液于96 孔酶標板上混勻，室溫下避光反應6 min后于734 nm波長處測定吸光度（Ai）。以50 μL甲醇代替樣品的反應體系為控制組（Ac），以150 μL PBS代替ABTS溶液的反應體系為樣品空白組（Aj），以50 μL甲醇和150 μL PBS分別代替樣品和ABTS溶液的反應體系為空白組（Ab）。采用兩倍稀釋法進行實驗，以槲皮素為陽性對照，結果用抑制率表示。實驗重復3 次，采用Origin 8.6軟件中的多項擬合計算樣品的IC50/（mg/mL）。ABTS陽離子自由基清除能力按1.3.4節公式計算。

1.3.6 還原能力的測定

參照Khadidja等[21]的方法評價樣品的還原能力。分別移取0.2 mL不同質量濃度的樣品溶液（1、2、4、6、8、10 mg/mL）與0.3 mL質量分數1%鐵氰化鉀混合，50 ℃水浴20 min后，加入0.3 mL質量分數10%三氯乙酸終止反應。分別加入0.6 mL的蒸餾水和0.15 mL質量分數0.1%三氯化鐵，搖勻后取200 μL溶液于700 nm波長處測定吸光度。0.15 mL的蒸餾水代替三氯化鐵作為空白對照。以槲皮素為陽性對照，ρ（OD0.5）表示使反應體系的光密度值為0.5時所需要的樣品質量濃度。實驗重復3 次。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 可溶性蛋白質量濃度分析結果

BSA-葡萄糖糖基化體系中的可溶性蛋白質量濃度變化如表1所示，在不同反應條件下，樣品之間的可溶性蛋白質量濃度具有相似的變化趨勢，均隨著反應時間延長和溫度遞增而降低，這說明BSA和葡萄糖之間發生了共價結合而消耗了BSA，從而促進糖基化反應進程。固定反應溫度為55 ℃，在反應時間超過36 h時，其可溶性蛋白質量濃度從1.025 mg/mL降低到72 h的0.894 mg/mL；固定反應時間為12 h，在反應溫度高于80 ℃時，其可溶性蛋白質量濃度從1.156 mg/mL顯著降低到90 ℃的0.177 mg/mL，且在100 ℃沒有檢測出。與反應時間相比，反應溫度的升高使可溶性蛋白質量濃度降低得更加明顯，這可能是因為高溫處理促進糖基化反應進程，BSA結構被破壞，更容易和葡萄糖發生共價結合，使得樣品中可溶性蛋白質量濃度顯著降低[22]。Guan Yongguang等[23]研究甘氨酸-葡萄糖體系時發現，隨著反應程度的加深，其甘氨酸含量下降得越快。

表1 反應時間和反應溫度對BSA-葡萄糖糖基化體系中可溶性蛋白質量濃度的影響Table 1 Effect of reaction time and temperature on soluble protein content in BSA-glucose glycosylation system

2.2 自由氨基質量濃度分析結果

糖基化反應是指還原糖的羰基與蛋白質的氨基之間發生共價結合的化學反應，可以通過測定反應體系中的自由氨基質量濃度來反映糖基化反應進程[24]。從圖1可以看出，樣品經糖基化反應后其自由氨基質量濃度顯著低于對照組BSA（P＜0.05），且其自由氨基質量濃度約比對照組BSA低0.11～0.21 mg/mL，說明BSA和葡萄糖之間發生反應消耗了BSA上的自由氨基?？赡艿脑蚴荁SA上的氨基酸殘基易發生氧化，其氨基基團的丟失導致自由氨基質量濃度下降，這和Meltretter等[25]報道基本一致。但當反應時間超過6 h時，樣品的自由氨基質量濃度變化較小，而當反應溫度高于60 ℃時，樣品的自由氨基質量濃度幾乎不再發生改變，這可能是因為當糖基化反應達到一定程度時，BSA-葡萄糖反應體系中的葡萄糖已被消耗，繼續延長反應時間或者升高反應溫度無法再提高反應程度，已經不能明顯改變自由氨基質量濃度[19]。

圖1 反應時間和反應溫度對BSA自由氨基質量濃度的影響Fig. 1 Effect of reaction time and temperature on the content of free amino groups in BSA

2.3 DPPH自由基清除能力分析結果

圖2 BSA-葡萄糖糖基化體系的DPPH自由基清除能力Fig. 2 DPPH radical scavenging capacity of BSA-glucose glycosylation system

表2 BSA-葡萄糖糖基化體系中DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力的IC50和還原能力的ρ（OD0.5）Table 2 IC50value for DPPH and ABTS cation radical scavenging capacity and ρ(OD0.5) for reduction power of BSA-glucose glycosylation system

本實驗采用DPPH自由基清除能力實驗比較不同反應條件下BSA-葡萄糖糖基化體系的抗氧化能力。樣品的DPPH自由基清除能力如圖2所示，其IC50如表2所示。在樣品的測試質量濃度范圍內（0.31～10.00 mg/mL），所有樣品的DPPH自由基清除能力均低于陽性對照槲皮素，但具有一定的DPPH自由基清除能力，且DPPH自由基清除能力隨著樣品質量濃度的遞增而增加。固定溫度為55 ℃，在反應48 h時制備的樣品具有最強的DPPH自由基清除能力，其IC50僅為1.17 mg/mL，其次為36 h時制備的樣品，反應72 h樣品的DPPH自由基清除能力最低，其IC50約為48 h時的2.9 倍；固定時間為12 h，在80 ℃條件下制備的樣品具有最強的DPPH自由基清除能力，其IC50僅為1.02 mg/mL，其次為70 ℃條件下制備的樣品，反應溫度為50 ℃時制備的樣品DPPH自由基清除能力最低，其IC50約為80 ℃時的2.6 倍。BSA-葡萄糖糖基化體系的抗氧化能力增加的原因是樣品經糖基化處理后，產生的糖基化產物（如類黑精[26]）具有供氫能力，與DPPH自由基結合形成DPPH-H分子，使得DPPH自由基清除能力提高[27]，同時Dong Shiyuan等[28]證實了葡萄糖的焦糖化作用會使DPPH自由基清除能力增加。持續延長反應時間或升高反應溫度，其DPPH自由基清除能力反而下降，這可能是因為隨著糖基化反應程度的加劇，糖基化產物的結構變得緊密，使一些與DPPH自由基反應的基團被包埋，導致其DPPH自由基清除能力降低[29]。因此，在固定溫度為55 ℃，反應48 h，或者固定反應時間為12 h，80 ℃條件下制備的糖基化產物具有最強的DPPH自由基清除能力。

2.4 ABTS陽離子自由基清除能力分析結果

圖3 BSA-葡萄糖糖基化體系的ABTS陽離子自由基清除能力Fig. 3 Effect of reaction time and temperature on ABTS cation radical scavenging capacity of BSA-glucose glycosylation system

BSA-葡萄糖糖基化體系中的ABTS陽離子自由基清除能力如圖3所示，其IC50如表2所示。樣品清除ABTS陽離子自由基能力的變化趨勢與DPPH自由基的變化趨勢相似，這可能是因為ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力都反映了樣品供氫的能力[30]。固定溫度為55 ℃，在反應48 h時制備的樣品具有最強的ABTS陽離子自由基清除能力，其IC50僅為0.92 mg/mL，其次為36 h時制備的樣品，而樣品在6 h時的ABTS陽離子自由基清除能力最低，其IC50約為48 h時的4.0 倍；固定時間為12 h，在90 ℃條件下制備的樣品具有最強的ABTS陽離子自由基清除能力，其IC50為0.58 mg/mL，但與80 ℃樣品的ABTS陽離子自由基清除能力無顯著性差異（P＞0.05），樣品在50 ℃時的ABTS陽離子自由基清除能力最低。在反應過程中，BSA-葡萄糖糖基化體系中的ABTS陽離子自由基清除能力先隨著反應程度的增加而增大，這是因為生成的部分中間產物和類黑精具有一定的抗氧化活性[31-32]，作為供氫體，使得糖基化改性后BSA的自由基清除能力提高；但在固定溫度為55 ℃、反應72 h，或者固定時間為12 h，100 ℃條件下制備樣品的ABTS陽離子自由基清除能力有所降低，這可能是因為隨著糖基化反應程度的持續增加，一些具有供氫能力的中間產物逐漸轉化形成結構復雜、聚合度不等的類黑精[31]，類黑精積累形成大量的黑色物質并難以溶解，使糖基化產物中主要的抗氧化活性成分含量降低，導致其ABTS陽離子自由基清除能力降低。綜合前期實驗[16]考慮，為了降低糖基化后期有害產物的積累，故選擇在固定溫度為55 ℃、反應48 h或者固定反應時間為12 h、80 ℃條件下制備糖基化產物，該條件下制得的糖基化產物具有較高的ABTS陽離子自由基清除能力。

2.5 還原能力分析結果

圖4 BSA-葡萄糖糖基化體系的還原能力Fig. 4 Effect of reaction time and temperature on reducing power of BSA-glucose glycosylation system

還原能力測定是指樣品溶液中的還原劑將鐵氰化鉀（三價鐵）還原成亞鐵氰化鉀（二價鐵），進一步與三氯化鐵反應生成普魯士藍，此時的樣品溶液在700 nm波長處具有最大光密度值，光密度值越大則代表樣品的還原能力越強[33]。BSA-葡萄糖體系中糖基化產物的還原能力結果如圖4所示，其ρ（OD0.5）如表2所示。隨著糖基化反應程度的增加，樣品的還原能力呈現出先增大后下降的趨勢（P＜0.05）。在固定溫度55 ℃，反應時間為48 h時制備的樣品具有最高的還原能力，其ρ（OD0.5）為3.25 mg/mL，其次是反應36 h制備的樣品，而樣品在72 h的還原能力最弱；在固定反應時間為12 h時，糖基化溫度為80 ℃時制備的樣品具有最高的還原能力，其ρ（OD0.5）僅為3.62 mg/mL，其次是70 ℃制備的樣品，而糖基化溫度為50 ℃時制備樣品的還原能力最弱。這是因為美拉德反應中間產物的酮基、高級產物的吡咯和羥基基團都具有一定的還原能力，所以樣品的還原能力與美拉德反應程度相關[28,34-35]。在糖基化反應過程中，其中間產物是發揮還原能力的主要活性物質，是良好的電子供體[36]，其供應的電子使Fe3+還原成Fe2+，導致樣品的還原能力增加。Yoshimura等[37]曾報道，隨著葡萄糖-甘氨酸混合物反應時間的延長，葡萄糖和甘氨酸提供了強還原材料，還原能力呈線性增加。而樣品還原能力下降的原因可能是隨著糖基化反應程度的增加，過度的熱處理或者高溫條件下使得部分具有還原能力的中間產物被分解所致。

3 結 論

本實驗以BSA-葡萄糖體系為糖基化反應模型，通過測定糖基化體系中的可溶性蛋白質量濃度、自由氨基質量濃度以及糖基化產物的DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力和還原能力，研究糖基化條件變化對糖基化反應程度以及糖基化產物的抗氧化能力的影響。結果表明，延長反應時間和升高反應溫度可促進糖基化反應的進程，使得BSA-葡萄糖體系中的可溶性蛋白和自由氨基質量濃度顯著下降。體外抗氧化實驗結果表明，樣品的DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力和還原能力隨著糖基化反應程度的增加呈現出先增大后降低的趨勢。結合前期不同反應條件對糖基化產物影響的研究，發現在55 ℃反應48 h或者80 ℃條件下反應12 h時制備的樣品具有較強的抗氧化能力。綜上，本研究為定向調控生產具備抗氧化能力的蛋白類食品，提高其品質、安全性，擴展食物資源提供了理論指導。