球磨法制備淀粉-芹菜素復合物及其消化性分析

張黎明，時文佳，張 麗，劉宇帆，何希宏，郝利民,2,*，魯吉珂

（1.天津科技大學 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.軍事科學院軍需工程技術研究所，北京 100010；3.鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450001）

淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成的天然大分子聚合物，其中直鏈淀粉在配體的誘導下可形成單螺旋鏈腔體結構，這種“內腔疏水外側親水”的單螺旋鏈結構能夠作為一種主體分子，通過疏水相互作用與疏水性客體分子形成復合物[1-2]。例如，它可以與一些客體分子如碘、脂類、黃酮類、表面活性劑等形成螺旋復合物[3]。通常，直鏈淀粉復合物的制備主要采用KOH/HCl溶液法[4]、水/二甲基亞砜法[5]和酶促聚合法[6]。這些方法存在生產周期長、成本高、產品得率低或有化學試劑殘留等問題，不適用于功能食品或營養強化食品的加工。近年來，采用物理法（超聲輔助制備法[7]、熱溶法[8]、蒸汽噴射蒸煮法[9]、高壓均質法[10]、擠壓蒸煮法[11]、球磨法[12]等）制備淀粉復合物受到了廣泛的關注。其中，球磨法是利用諸如摩擦、碰撞、剪切等外力作用來改變淀粉顆粒結構和性質的物理改性方法，具有操作簡單、可控性強、可間歇也可連續工作、研磨物料便于更換、成本低、環境友好等優點[13]。研究結果表明，球磨處理能夠改變淀粉的理化性質，包括溶解性、相對結晶度、顆粒形態和粒徑分布、分子質量、直鏈淀粉/支鏈淀粉比等[13-14]。劉燦燦等[15]研究了檳榔芋淀粉的球磨和辛烯基琥珀酸酯化復合改性，結果顯示，與原淀粉相比，球磨和酯化復合改性淀粉在球磨機械力作用下分子鏈斷裂，更容易吸水，淀粉的膨潤力、透明度和溶解度明顯增強。本課題組前期研究發現，淀粉與茶多酚共球磨處理后淀粉顆粒團聚黏連，抗性淀粉含量增多，淀粉的特征衍射峰強度減弱，相對結晶度下降[16]。

芹菜素是一種黃酮類化合物，它可以抑制α-淀粉酶的活性，導致淀粉的水解速率減緩，抗性淀粉含量增加，進而可以控制機體的血糖水平[17]。劉春穎等[18]也探討了芹菜素對α-葡萄糖苷酶、麥芽糖酶和蔗糖酶活性的影響，結果表明，芹菜素可以競爭性抑制α-葡萄糖苷酶、麥芽糖酶和蔗糖酶的活性。Panda等[19]發現，灌胃芹菜素后能顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平，這些對于降低糖尿病患者餐后血糖濃度具有重要的指導意義。但芹菜素的水溶性和脂溶性均較差，直接口服后胃腸道吸收差，生物利用率低[20]。因此，本實驗選用球磨法制備玉米淀粉-芹菜素復合物，旨在將芹菜素與玉米淀粉相結合，通過芹菜素的釋放和抑制消化酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的活性從而降低和延緩淀粉的消化。同時在球磨的作用下降低芹菜素的結晶度，增加其表面活性及分散度，提高其溶出度[21]，最終提高芹菜素的生物利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉（食品級）（水分質量分數13%～14%、直鏈淀粉質量分數20%～30%） 山東壽光巨能金玉米開發有限公司；芹菜素（純度高于98%） 天津江萊生物有限公司；芹菜素標準品（純度不低于98%） 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖標準品 天津市化學試劑一廠；豬胰α-淀粉酶（290 U/mL） 美國Sigma公司；糖化酶（15 U/mL） 北京Solarbio公司；乙腈（色譜純） 天津市津東天正精細化學試劑廠；甲醇（色譜純）、無水乙醇 德國默克有限公司。

1.2 儀器與設備

XQM-0.4型星式球磨機 湖南長沙天創粉末科技有限公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；XL-30型掃描電子顯微鏡 荷蘭飛利浦公司；D/max 2500型X射線衍射儀 日本理學株式會社；Vector-22型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）儀 德國布魯克儀器公司；BS-2FS型立式恒溫恒濕搖床 蘇州威爾實驗用品有限公司；高效液相色譜分析儀 美國Agilent公司；Q50熱重分析儀 上海萊睿科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉-芹菜素復合物的制備方法及單因素試驗

玉米淀粉-芹菜素復合物的制備參考文獻[16]報道的方法。將芹菜素和玉米淀粉置于陶瓷罐（100 mL）中，再加入不同直徑（5、10 mm和15 mm）的氧化鋯球共30.0 g。將球磨機負荷設定為15.0 g，設定球、料質量比接近2∶1，球、料總體積控制在球磨罐總體積的1/3～2/3范圍內，轉速設定為700 r/min，分別以球磨處理時間和m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）為單因素變量進行淀粉-芹菜素復合物的制備。首先考察球磨處理時間的影響：將10.0 g玉米淀粉和1.0 g芹菜素放入球磨罐中進行球磨，共處理35 h，以5 h為間隔找出較佳的球磨處理時間。

確定較佳的球磨時間后，將球磨時間固定不變，考察m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）的影響，以10.0 g玉米淀粉分別和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g的芹菜素混合研磨，確定復合物制備的較佳玉米淀粉/芹菜素質量比。球磨處理結束后，用無水乙醇洗去復合物表面未結合的芹菜素，抽濾，將所得復合物在37 ℃的恒溫干燥箱中烘干，研磨并過100 目篩。實驗過程中采用球磨玉米淀粉作為空白對照，即不加芹菜素進行球磨30 h的實驗組。淀粉與芹菜素物理混合物的制備方法：根據實驗所篩選的較佳條件下制備的復合物中玉米淀粉含量和芹菜素含量，精確稱量928.5 mg玉米淀粉和71.5 mg芹菜素，放置于10 mL帶蓋離心管中，振蕩5 min后過100 目篩，作為方法對照。

1.3.2 淀粉-芹菜素復合物中芹菜素含量及復合率的測定

復合物中芹菜素的含量測定參考Wang Keqin等[22]的方法。精確稱取復合物200 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，于25 ℃條件下超聲30 min，冷卻至室溫，取上清液過0.22 μm濾膜待用。色譜條件如下：色譜柱C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（35∶65，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；紫外檢測波長為270 nm；進樣量10 μL。

采用外標法計算球磨后復合物中芹菜素含量，根據芹菜素的標準品校正曲線方程Y＝37.30X-33.06，進樣質量濃度在0～160 μg/mL范圍內芹菜素含量與峰面積呈良好的線性關系（R2＝0.999）。芹菜素的復合率按式（1）計算。

式中：ma為復合物中芹菜素的質量/mg；mb為初始投入芹菜素的質量/mg。

1.3.3 淀粉-芹菜素復合物的結構表征

1.3.3.1 掃描電子顯微鏡觀察

將導電膠依次固定在掃描電子顯微鏡樣品臺上，用藥匙將樣品均勻平整地鋪在導電膠表面，吹掃多余的樣品顆粒。用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍金60 s。用掃描電子顯微鏡進行觀察并拍照，加速電壓設為6 kV，放大倍數為2 000 倍[23]。

1.3.3.2 X射線衍射分析

取適量樣品于托盤片的中央，用光滑的玻片將樣品壓成厚1 mm、寬13 mm的薄片并固定。采用連續掃描的方式，測定條件如下：電壓40 kV，電流35 mA，2θ掃描區域4°～35°，掃描速率4°/min，采樣步寬0.02°，縫寬為2 mm，接收狹縫寬為1 mm[24]。

1.3.3.3 FT-IR分析

在瑪瑙研缽中加入樣品約2 mg、溴化鉀150 mg，均勻研磨，然后將混合物倒入壓片器中壓成近透明的片材，片厚1 mm左右，隨后取出樣品薄片進行紅外光譜掃描。掃描范圍為500～4 000 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，信號掃描累計16 次。

1.3.3.4 熱重分析

選用銦標定儀器，依次取10 mg左右樣品置于樣品鉑金坩堝中，升溫區間25～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min。氮氣作為保護氣體，氣體流量60 mL/min。

1.3.4 淀粉-芹菜素復合物的體外消化性測定

玉米淀粉-芹菜素復合物的體外消化性測定參考Sang等[25]的方法并稍作改進。考慮m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）的不同對實際可用于消化淀粉含量的影響，在消化性測定中，以復合物樣品中含有200 mg淀粉的量為基準稱取樣品。分別將不同m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）的復合物（質量比分別為20∶1、20∶2、20∶3、20∶4、20∶5）放置于5 個裝有20 mL pH 5.2磷酸鹽緩沖溶液的燒杯中，在37 ℃、40 r/min轉速恒溫搖床上平衡5 min后依次倒入5 個透析袋中，并在透析袋中加入6 顆氧化鋯球（直徑5 mm）、10 mL混酶（α-淀粉酶290 U/mL、糖化酶15 U/mL），用夾子夾緊透析袋兩端，將透析袋分別放入裝有80 mL磷酸鹽緩沖溶液的燒杯中并做標記，蓋上保鮮膜。在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h時各取樣2 mL，取樣后及時用等體積磷酸鹽緩沖溶液補足溶液體積。采用3,5-二硝基水楊酸法測定吸光度。葡萄糖釋放量的測定采用外標法，依據葡萄糖的標準品校正曲線方程Y＝10.61X-0.018，進樣質量濃度在0～50 μg/mL范圍內葡萄糖的含量與吸光度呈良好的線性關系（R2＝0.998）。體外消化率按式（2）計算。

式中：ma為葡萄糖的釋放量/mg；mb為淀粉的質量/mg。

1.4 數據統計與分析

采用Origin 8.0軟件處理實驗數據，結果取3 次實驗的平均值，以平均值±標準差表示。顯著性分析采用鄧肯氏多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 制備條件對淀粉-芹菜素復合物中芹菜素含量和復合率的影響

2.1.1 球磨處理時間對復合物中芹菜素含量和復合率的影響

圖1 球磨處理時間對復合物中芹菜素含量和復合率的影響Fig. 1 Effect of ball milling time on the content and percent complexation of apigenin in the complex

由圖1可知，球磨時間5～10 h時，芹菜素的含量和復合率上升趨勢明顯，這可能是由于玉米淀粉的結構在球磨外力的作用下開始發生改變，直鏈淀粉單螺旋空腔已經大量暴露，使得芹菜素和淀粉包合速率加快。當球磨時間從10 h延長到30 h時，芹菜素的含量和復合率上升趨勢減緩，可能是直鏈淀粉可供芹菜素占據的單螺旋結合點逐漸減少造成的。當球磨時間超過30 h后，直鏈淀粉與芹菜素的結合量開始下降，可能是球磨時間過長，玉米淀粉的形態和結構均被破壞，可供芹菜素結合的位點也隨之被破壞。因此，玉米淀粉-芹菜素復合物制備的較優球磨時間為30 h。

2.1.2 m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）對復合物中芹菜素含量和復合率的影響

圖2 m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）對復合物中芹菜素含量和復合率的影響Fig. 2 Effect of starch∶apigenin ratio on the content and percent complexation of apigenin in the complex

由圖2可知，當m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）從20∶1增加到20∶4時，隨著芹菜素比例的增加，玉米淀粉-芹菜素復合物中芹菜素的含量逐漸增加到71.5 mg/g，芹菜素的復合率在m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）為20∶4時達到最高（35.7%）。當m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）由20∶4增加到20∶5時，復合物中的芹菜素含量基本不變，說明直鏈淀粉單螺旋空腔上的結合位點已被芹菜素占據完全。從圖2中還可以看出，m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）大于20∶4后芹菜素的復合率開始下降，這可能是由于，當投入的芹菜素過量時，會影響淀粉的球磨改性效果，所形成直鏈淀粉的結合位點增加有限，過量的芹菜素并不會與淀粉結合，導致芹菜素的復合率下降，造成了芹菜素的浪費。因此，球磨法制備復合物的玉米淀粉-芹菜素的較優質量比為20∶4。

2.2 淀粉-芹菜素復合物的結構表征

2.2.1 掃描電子顯微鏡分析結果

由圖3可知，芹菜素形貌為無規則晶體狀顆粒（圖3a）。玉米原淀粉呈不規則的顆粒狀，顆粒棱角明顯、不圓潤，顆粒大小不均勻（圖3b）。將二者物理混合后結果顯示，芹菜素附著在玉米淀粉顆粒表面，淀粉和芹菜素的形狀均未改變（圖3c）。球磨后的芹菜素呈團聚態（圖3d）。球磨后的玉米淀粉（圖3e）與玉米原淀粉在形貌上存在明顯差異，主要表現在球磨后淀粉顆粒表面破碎，出現裂紋，多個淀粉顆粒團聚形成更大的淀粉粒子。這主要是淀粉受球磨碰撞力、擠壓力及摩擦力所致[14]。與球磨后的淀粉相比，采用球磨法制備的復合物因芹菜素的遷入淀粉表面無裂紋，淀粉顆粒表面變得更加粗糙，淀粉顆粒的破損度和團聚現象明顯提高，芹菜素與淀粉黏連形成扁平顆粒狀聚集體（圖3f）。

圖3 芹菜素、玉米淀粉、物理混合物、球磨芹菜素、球磨玉米淀粉、復合物的掃描電子顯微鏡圖（2 000×）Fig. 3 SEM images of apigenin, corn starch and their physical mixture,as well as milled apigenin, milled corn starch and their complexes (2 000 ×)

2.2.2 X射線衍射分析結果

圖4 芹菜素、玉米淀粉、物理混合物、球磨芹菜素、球磨玉米淀粉、復合物的X射線衍射圖Fig. 4 X-ray diffraction patterns of apigenin, corn starch and their physical mixture, as well as milled apigenin, milled corn starch and their complexes

由圖4曲線a可知，芹菜素出現許多很強的X射線衍射峰，表明其具有良好的結晶結構。球磨后的芹菜素（圖4曲線d）在2θ為25.0°～33.0°之間的衍射峰明顯減弱，部分衍射峰消失，說明單獨球磨處理芹菜素可以降低芹菜素的結晶度，但其結晶性仍較明顯。玉米原淀粉（圖4曲線b）在2θ為15.0°、17.0°、18.0°和23.0°處出現衍射峰，表明玉米淀粉具有A型結晶結構[26]。二者經物理混合物后，X射線衍射譜圖顯示其保留了玉米淀粉和芹菜素二者的部分結晶特征（圖4曲線c）。由圖4曲線e可知，球磨處理后玉米淀粉的特征衍射峰消失，淀粉的結晶度明顯下降。造成這種結果的原因可能是，球磨機械力使淀粉分子鏈間的排布方式改變，減弱了分子間及分子內氫鍵的相互作用，導致分子鏈排列雜亂無序所致[27]。與玉米原淀粉和芹菜素物理混合物相比，采用球磨法制備的復合物（圖4曲線f）并沒有顯示原淀粉和芹菜素各自的特征衍射峰，淀粉-芹菜素復合物基本處于無定形狀態，表明玉米淀粉與芹菜素之間存在相互作用，一方面芹菜素的遷入加速了淀粉結晶結構的消失；另一方面，淀粉的存在增加了芹菜素的分散度，有利于芹菜素結晶結構的破壞。

2.2.3 FT-IR分析結果

圖5 芹菜素、玉米淀粉、物理混合物、球磨芹菜素、球磨玉米淀粉、復合物的FT-IR圖Fig. 5 FT-IR of apigenin, corn starch and their physical mixture, as well as milled apigenin, milled corn starch, and their complexes

由圖5可知，芹菜素（圖5曲線a）在1 608～1 588、828 cm-1處為苯環特征吸收峰[28]，球磨后的芹菜素（圖5曲線d）與原芹菜素（圖5曲線a）相比沒有原基團的消失也沒有新基團的產生，說明球磨作用沒有破壞芹菜素的分子基團結構。原玉米淀粉（圖5曲線b）在3 100～3 700 cm-1處是羥基O—H伸縮振動吸收峰，2 800～3 050 cm-1處為飽和的C—H伸縮振動吸收峰，1 081 cm-1處為環氧基C—O—C特征吸收峰。球磨處理后的淀粉（圖5曲線e）在3 080～3 730 cm-1處的羥基O—H特征吸收峰明顯比玉米原淀粉（圖5曲線b）強，這主要歸因于球磨處理使氫鍵的結合模式發生改變，說明球磨作用改變了淀粉分子間氫鍵的相互作用[29]。將玉米淀粉和芹菜素物理混合后（圖5曲線c），玉米原淀粉和芹菜素的特征峰疊合，但仍然具有芹菜素的苯環特征吸收峰。與物理混合物（圖5曲線c）相比，玉米淀粉-芹菜素復合物（圖5曲線f）在1 608～1 588、828 cm-1處的芹菜素的苯環特征吸收峰基本消失，說明淀粉與芹菜素有較強的相互作用，可能是大量的芹菜素與玉米淀粉發生復合作用，芹菜素被包結于淀粉的螺旋空腔內或空腔間，使得芹菜素的特征吸收峰不再明顯。FT-IR顯示玉米淀粉和芹菜素發生了相互作用，但沒有生成新的基團，說明兩者之間發生的是非共價相互作用。

2.2.4 熱重分析結果

圖6 芹菜素、玉米淀粉、物理混合物、球磨芹菜素、球磨玉米淀粉、復合物的熱重分析曲線Fig. 6 Thermal gravimetric curves of apigenin, corn starch and their physical mixture, as well as milled apigenin, milled corn starch,and their complexes

由圖6可以看出，芹菜素（圖6曲線a）及球磨芹菜素（圖6曲線d）只有一個熱失重峰，其起始分解溫度約在365 ℃，穩定性相對最高，且球磨后芹菜素的熱穩定性增強。玉米淀粉（圖6曲線b）、球磨后的玉米淀粉（圖6曲線e）、物理混合物（圖6曲線c）的失重曲線在300 ℃之前基本相似，均在100 ℃前先失水，到300 ℃時達到第一個平臺期；當溫度從300 ℃升高至350 ℃之間進入第二失重階段，350 ℃時之后進入第二個平臺期。最終玉米淀粉（圖6曲線b）、球磨玉米淀粉（圖6曲線e）、物理混合（圖6曲線c）剩余質量分別為初始質量的11.11%、11.52%、13.46%。從圖6還可以看出，復合物（圖6曲線f）在100 ℃和300～350 ℃兩個失重階段的質量損失均低于球磨淀粉（圖6曲線e）和其物理混合物（圖6曲線c），復合物的最終剩余質量為初始質量的22.14%，說明與芹菜素復合后提高了淀粉的熱穩定性。

2.2.5 體外消化性分析結果

由圖7可知，當體外模擬消化時間從0 h延長到4 h時，所有樣品的消化率都呈現增加的趨勢，4 h后消化率基本維持不變。由圖7還可以看出，在體外模擬消化性實驗中，球磨后玉米淀粉（圖7曲線a）的消化率最高（約50%），而玉米原淀粉（圖7曲線b）的體外消化率最高只有43%。這是由于球磨使玉米淀粉顆粒和結晶結構遭到破壞，呈現非晶態結構，淀粉酶更容易進入淀粉顆粒內部對淀粉進行酶解，因此更有利于淀粉的消化。與玉米淀粉（圖7曲線b）和球磨玉米淀粉（圖7曲線a）相比，玉米淀粉-芹菜素復合物的消化率顯著降低。這與芹菜素的加入有關，根據莊俊鈺等[30]的報道，芹菜素對α-淀粉酶的抑制率為27.6%，有著較高的酶抑制活性。玉米淀粉-芹菜素復合物（圖7曲線c～e）的最終消化率分別為28.9%、25.7%、18.8%，隨著復合物中芹菜素含量的增加，淀粉的消化率逐漸下降，說明芹菜素的含量與淀粉的消化率呈負相關性。這與屠潔等[31]研究得出的芹菜素能與α-葡萄糖苷酶分子底物結合部位的氨基酸基團形成氫鍵和疏水作用，從而競爭性地抑制α-葡萄糖苷酶對淀粉的最終消化作用這一結論相一致。

圖7 玉米淀粉、球磨玉米淀粉、復合物的體外消化性分析Fig. 7 In vitro digestibility of corn starch, milled corn starch and their complexes

3 結 論

通過球磨法制備玉米淀粉-芹菜素復合物的較優條件為球磨時間30 h、m（玉米淀粉）∶m（芹菜素）為5∶1，在此條件下芹菜素的復合率最高，為35.7%，每克淀粉中的芹菜素質量為71.5 mg。掃描電子顯微鏡結果顯示球磨使得玉米淀粉顆粒形貌發生改變，表面變得粗糙有裂紋，并發生團聚現象。芹菜素在長時間的球磨外力下與淀粉相互結合形成復合物。復合物表面粗糙無裂紋，呈扁平顆粒狀聚集體。X射線衍射分析表明，形成復合物后淀粉的特征衍射峰強度減弱，淀粉的結晶結構被破壞，結晶度降低，且芹菜素的存在加速了淀粉結晶區的破壞。FT-IR顯示玉米淀粉和芹菜素發生了相互作用，但沒有生成新的基團，說明兩者之間發生的是非共價相互作用。熱重分析結果表明形成復合物的熱穩定性增強。體外消化性評價結果顯示淀粉-芹菜素復合物的形成，能抑制淀粉的消化，減緩淀粉的酶解速率，增加淀粉的抗消化性。球磨法雖然具有操作簡單、成本低、環境友好等優點，但由于影響因素較多而重現性較差，今后在放大實驗過程中應該充分考慮相關影響因素，如設備型號、球磨方式、球磨罐體積、球料比等。