超聲輔助2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基催化制備綠豆氧化淀粉及其結構與性質(zhì)分析

范金波，李鑫芮，孔 洋，呂長鑫*

（渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

我國綠豆種植面積及產(chǎn)量居世界前列，是最大的綠豆出口國，綠豆種植主要分布在吉林、內(nèi)蒙古、河北、安徽、陜西等省[1]。據(jù)報道，綠豆中淀粉質(zhì)量分數(shù)為31.1%、氮質(zhì)量分數(shù)為0.05%、總脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為0.32%，并含有多種維生素和礦質(zhì)元素，是植物蛋白質(zhì)的重要來源[2-4]。但目前我國對綠豆產(chǎn)業(yè)的重視程度不夠，對綠豆淀粉的開發(fā)利用還處于起步階段，導致綠豆的加工開發(fā)難以跟上現(xiàn)代化食品工業(yè)的發(fā)展步伐[5]。

氧化淀粉能顯著改善天然淀粉不溶于冷水，在酸、熱等條件下不穩(wěn)定的現(xiàn)象。目前最常用的氧化劑為次氯酸鈉、過氧化氫等，常用的催化劑為金屬離子，但其使用會導致淀粉產(chǎn)品中有金屬離子殘留。近年來，2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2,2,6,6-tetramethyl-piperidine-1-oxyl，TEMPO）催化氧化法引起了研究人員的興趣，它可在仲醇存在的情況下特異性地氧化伯醇基團。de Nooy等提出以TEMPO為催化劑，以溴化鈉和次氯酸鈉為氧化劑的催化氧化體系，葡聚糖及其衍生物伯醇基被迅速完全氧化[6]，該體系在單糖和雙糖氧化中同樣適用[7]。TEMPO-次氯酸鈉介導氧化已應用于各種多糖的氧化，Bragd等對馬鈴薯淀粉的無溴氧化進行了研究，當溫度低于20 ℃和pH值低于9.0時，馬鈴薯淀粉的解聚作用非常微弱，在35 ℃、pH 8.5時制備的氧化淀粉溶脹和溶解能力、透明度增加，并能延遲淀粉凝膠退化[8]。因此本研究選擇TEMPO為催化劑，其反應條件溫和、選擇性好、用量少，是一種綠色環(huán)保氧化方法。超聲處理是常用的物理加工技術，具有頻率高、波長短、穿透性強等特點，研究表明，超聲輔助法是一種適應性強、使用方便、效果良好的聚合物改性方法[9-11]。

本研究旨在以綠豆淀粉為原料，探索超聲輔助TEMPO催化氧化法制備氧化淀粉的工藝參數(shù)，探究超聲處理對淀粉氧化的影響，并對氧化淀粉進行結構表征和性質(zhì)分析。以期為氧化淀粉制備方法的探索和綠豆深加工提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆淀粉 河南恩苗食品有限公司；次氯酸鈉天津市北辰方正試劑廠；TEMPO（純度高于98%）酷爾化學科技（北京）有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、硫代硫酸鈉、酚酞均為分析純。

1.2 儀器與設備

JRA-20CQ智能型低溫超聲波萃取儀 無錫杰瑞安儀器設備有限公司；SK6210HP超聲波清洗器上海科導超聲儀器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；L6S紫外-可見分光光度計 上海儀電科學儀器有限公司；DHR-1旋轉流變儀美國TA公司；90Plus Zeta型Zeta電位及粒度分析儀 美國布魯克海文儀器公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；S-4800掃描電子顯微鏡 日本株式會社日立制作所；Ultima IV組合式多功能X射線衍射儀 日本理學株式會社。

1.3 方法

1.3.1 綠豆氧化淀粉制備

綠豆TEMPO氧化淀粉制備：準確稱取20 g（干基質(zhì)量）綠豆原淀粉為原料，加入適量蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)40%左右的淀粉乳液，將質(zhì)量分數(shù)0.1%的TEMPO作為催化劑溶于淀粉乳中，固定反應溫度10 ℃，反應時間90 min，依次考察氧化劑次氯酸鈉的添加量、反應pH值對氧化度及得率的影響，反應過程中不斷攬拌，并用2 mol/L的氫氧化鈉溶液控制溶液pH值，待反應結束后，用適量NaHSO3溶液終止反應，調(diào)節(jié)pH值為6.5，靜置1 h后，加入200 mL的無水乙醇，醇沉8 h，之后抽濾并用體積分數(shù)60%乙醇溶液反復洗滌，直至溶液呈中性為止，將固形物放入電熱鼓風干燥箱中（50 ℃）干燥，之后研磨、粉碎，即得綠豆氧化淀粉產(chǎn)品，每個樣品重復3 次[12]。

氧化劑添加量對淀粉氧化度及得率的影響：氧化劑的添加量以氧化劑物質(zhì)的量與淀粉含有葡萄糖單元物質(zhì)的量比表示，記為氧化劑物質(zhì)的量比，固定氧化反應過程中TEMPO添加量0.1%、反應溫度10 ℃、反應時間90 min、反應pH 8.5左右，探討氧化劑添加量對淀粉氧化度及得率的影響。

反應pH值對淀粉氧化度及得率的影響：固定氧化反應過程中TEMPO添加量0.1%，反應溫度10 ℃，反應時間90 min，氧化劑添加量1.5∶1（以氧化劑物質(zhì)的量與淀粉含有葡萄糖單元物質(zhì)的量比表示，后同），探討反應pH值對淀粉氧化度及得率的影響。

超聲輔助氧化淀粉制備：固定氧化反應過程中TEMPO添加量0.1%，氧化劑添加量1.5∶1，反應溫度10 ℃，反應時間90 min，反應pH 8.5左右，固定超聲功率500 W，選擇超聲頻率分別為25、45、53 kHz，考察超聲處理對氧化度及得率的影響。

1.3.2 氧化度的測定

參考Mattisson等[13]的方法稍作修改。稱取5 g氧化淀粉于150 mL燒杯中，加入25 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，充分攪拌后過濾，并用去離子水洗至無氯離子為止（脫灰，用硝酸鹽檢驗），脫灰后將樣品轉移到500 mL燒杯中，加入300 mL去離子水，加熱煮沸5～7 min，以酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定到終點，消耗的體積記為V1/mL。空白實驗：在500 mL的燒杯中加入5 g原淀粉和300 mL蒸餾水并糊化，用氫氧化鈉標準溶液滴定至酚酞變色，消耗的體積記為V2/mL。氧化度以羧基質(zhì)量分數(shù)表示，可由下式計算。

式中：m1為氧化淀粉質(zhì)量/g；m2為原淀粉質(zhì)量/g；c為氫氧化鈉溶液濃度/（mol/L）。

1.3.3 氧化淀粉得率測定

將醇沉后的淀粉乳液抽濾并用無水乙醇反復洗滌，直至溶液呈中性為止，將固形物放入電熱鼓風干燥箱中（50 ℃）干燥，恒質(zhì)量后研磨、粉碎，根據(jù)干燥后固形物質(zhì)量比干燥前固形物質(zhì)量計算得率。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察淀粉顆粒微觀形貌

參考錢建亞等[14]的方法稍作修改，將綠豆原淀粉及不同條件制備的氧化淀粉過100 目篩，取少量用雙面膠固定在支持網(wǎng)上并噴金，將噴金后的樣品固定在試樣支持器中，對淀粉的顆粒形貌進行觀察并拍攝照片。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析淀粉顆粒結構變化

參考Ding Longlong等[15]的方法，將綠豆原淀粉及不同條件制備的氧化淀粉過100 目篩，采用KBr壓片法，將樣品置于傅里葉變換紅外光譜儀中進行400～4 000 cm-1內(nèi)全波段掃描，掃描次數(shù)為32 次。

1.3.6 淀粉結晶結構分析

參考楊小玲等[16]的方法稍作修改，將綠豆原淀粉及不同條件制備的氧化淀粉過100 目篩備用，選用玻璃樣品架，將樣品放入樣品架的凹槽中，用毛玻璃壓平，將樣品插入樣品臺，關閉防護門，進行樣品測試，掃描范圍5°～55°，步長0.02°。

1.3.7 淀粉Zeta電位的測定

將綠豆原淀粉及不同條件制備的氧化淀粉配制成4 mg/mL的淀粉乳液，加熱煮沸5 min后冷卻至25 ℃左右，置于樣品槽內(nèi)，插入電極，進行測定。

1.3.8 淀粉黏度的測定

準確稱量6 g綠豆原淀粉及不同條件制備的氧化淀粉，轉移至三口圓底燒瓶內(nèi)，加100 mL蒸餾水，配制成質(zhì)量分數(shù)6%的淀粉乳液，水浴加熱至95 ℃，在此溫度下中速攪拌15 min，糊化結束后冷卻至室溫，置于流變儀中，在剪切速率0.1～100 s-1內(nèi)測定其黏度。

1.3.9 淀粉粒徑的測定

將綠豆原淀粉及不同條件制備的氧化淀粉配制成4 mg/mL的淀粉乳液，加熱煮沸5 min后冷卻至25 ℃左右，置于粒度分析儀樣品槽內(nèi)進行測定。

1.3.10 淀粉透光率的測定

參考梁建蘭等[17]的方法稍作修改，準確稱量0.5 g綠豆原淀粉及不同條件制備的氧化淀粉，加50 mL蒸餾水，水浴煮沸加熱15 min不斷攪拌，并維持原有體積，冷卻至25 ℃，在620 nm波長處測定其透光率，以蒸餾水為空白（透光率100%）。

1.3.11 淀粉溶解度的測定

參考岳曉霞等[18]的方法稍作修改，準確稱量2.5 g綠豆原淀粉及不同條件制備的氧化淀粉，加50 mL蒸餾水，配制成質(zhì)量分數(shù)5%的淀粉乳液，85 ℃攪拌30 min，冷卻至室溫后4 000 r/min離心10 min，取上清液于100 ℃下烘干，于105 ℃烘至恒質(zhì)量。溶解度即為上清液干燥后的淀粉質(zhì)量與淀粉樣品干物質(zhì)的質(zhì)量比。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗平行測定3 次，結果表示為平均值±標準差；采用SPSS 17.0軟件的Duncan多重檢驗進行顯著性分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 綠豆氧化淀粉條件優(yōu)化結果

2.1.1 氧化劑添加量對淀粉氧化度及得率的影響

圖1 氧化劑添加量對淀粉氧化度及得率的影響Fig. 1 Effect of oxidant amount on degree of oxidation and yield of oxidized starch

從圖1可以看出，氧化淀粉的氧化度隨著氧化劑添加量的增加而增加，當氧化劑與淀粉含有葡萄糖單元物質(zhì)的量比從1∶1增加到1.5∶1時，氧化度從27.88%提高到51.08%，增加了83.21%；而當氧化劑添加量繼續(xù)增加時，氧化度無明顯改變，說明氧化反應已基本完成。此外，次氯酸鈉添加量過多時，氧化劑是過量的，同時從實驗數(shù)據(jù)來看添加量越大時誤差也越大，氧化淀粉的得率呈下降趨勢，因此，次氯酸鈉與淀粉含有葡萄糖單元物質(zhì)的量比1.5∶1左右較為合適。

2.1.2 反應pH值對淀粉氧化度及得率的影響

圖2 反應pH值對淀粉氧化度及得率的影響Fig. 2 Effect of reaction pH on degree of oxidation and yield ofoxidized starch

從圖2可以看出，氧化度隨pH值先增大后減小，pH 8.5～9.0時氧化度最高，最大值近50%，但當pH值繼續(xù)增大時，氧化度降低，當溶液堿性減弱或增強時，氧化度均有不同程度的下降。這是因為，在淀粉的葡萄糖單元C2、C3和C6這3 個碳原子上有游離的羥基，在弱堿性條件下，TEMPO共氧化體系主要是氧化C6的羥基，因為C6羥基空間位阻小且是伯碳原子，伯碳原子上的氫更易以質(zhì)子的形式離去，因此更容易被氧化[19]。

從圖2還可以看出，隨著pH值的增大得率顯著下降，一方面是由于在強堿性條件下pH值的提高會降低氧化反應速率[20]；另一方面是由于反應介質(zhì)的堿性增強加劇了淀粉的降解，但在弱堿性條件下，淀粉以中性形式存在，反應速度較快。綜上，TEMPO氧化體系氧化淀粉反應pH值以8.5為宜。

2.1.3 超聲頻率對淀粉氧化度及得率的影響

圖3 不同超聲頻率對淀粉氧化度及得率的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic frequency on degree of oxidation and yield of oxidized starch

從圖3中可以看出，不同超聲頻率對淀粉氧化度的影響各不相同，未超聲處理組的氧化度為40.54%，超聲25 kHz處理組的氧化度為41.42%，較未超聲組增長了2.17%，45 kHz和53 kHz處理組的氧化度分別為35.50%和28.49%，較未超聲組降低了12.43%和29.72%。可能是因為超聲波可以促進淀粉分子降解，使分子鏈斷裂，超聲波頻率越大，產(chǎn)生的部分空化泡半徑大于淀粉顆粒半徑[21]，對其造成的破壞作用減弱，導致淀粉顆粒與氧化劑之間的接觸面積減少，氧化度降低。

從圖3可以看出，氧化淀粉得率變化趨勢與氧化度相一致，低頻超聲促進氧化反應的進行，而高頻抑制氧化反應的進行，得率隨著頻率的升高呈現(xiàn)顯著下降趨勢。

2.2 掃描電子顯微鏡觀察結果

圖4 綠豆原淀粉及氧化淀粉掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron microscopic images of intact and oxidized mung bean starch

由圖4可以看出，綠豆原淀粉顆粒完整、表面光滑致密、無缺陷及裂紋；綠豆淀粉經(jīng)未超聲氧化處理后，顆粒表面出現(xiàn)明顯的破損裂紋，表面有較多的孔洞出現(xiàn)，部分顆粒破裂，與文獻[22]結果一致。綠豆淀粉經(jīng)25 kHz超聲和氧化劑同時作用時，淀粉破損顆粒數(shù)量增多，表面同樣受到侵蝕，變得粗糙，出現(xiàn)孔洞，且超聲頻率25 kHz作用的淀粉氧化程度較高，淀粉表面損壞程度變大。這可能是因為超聲波作用于淀粉溶液時，淀粉顆粒受到強大的沖擊作用，造成局部高溫高壓，使分子內(nèi)部結構發(fā)生改變，出現(xiàn)孔洞，超聲波與氧化劑同時作用，促進淀粉大顆粒分子降解；因此淀粉顆粒表面出現(xiàn)更多、更深的孔洞。超聲頻率45 kHz處理的氧化淀粉表面粗糙，有破損裂紋，顆粒受到侵蝕，但與未超聲及超聲頻率25 kHz氧化淀粉相比孔洞及破碎顆粒出現(xiàn)較少；超聲53 kHz處理的氧化淀粉表面粗糙，有破損裂紋，顆粒受到侵蝕，但與超聲頻率45 kHz氧化淀粉相比孔洞出現(xiàn)較少，顆粒破碎數(shù)量減少。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析結果

圖5 綠豆原淀粉及氧化淀粉傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of raw and oxidized mung bean starch

從圖5中可以看出，原淀粉在3 460 cm-1處吸收峰峰寬變窄，主要是由于氧化劑進入淀粉顆粒內(nèi)部，產(chǎn)生了一定的氧化降解作用，從而導致淀粉顆粒結構松散，淀粉大分子間氫鍵締合作用減弱[23]。各個處理組保持了在562、990、1 158、1 349、2 929 cm-1處的淀粉特征吸收峰；與原淀粉比較，改性后的氧化淀粉葡萄糖單元中OH的O—H伸縮振動（3 435cm-1）吸收峰急劇變?nèi)酰f明氧化作用發(fā)生在C2、C3、C6的—OH，同時還可發(fā)現(xiàn)，未超聲處理組和超聲25 kHz處理組在1 733 cm-1處出現(xiàn)了較弱的吸收峰，可以判斷其是由C＝O的伸縮振動引起的，說明產(chǎn)物中有一定數(shù)量的羧基存在，未超聲處理組和超聲25、45、53 kHz處理組在1 613～1 637 cm-1出現(xiàn)了明顯的羧基吸收峰，說明淀粉被成功氧化，得到了目標產(chǎn)物。

2.4 淀粉結晶結構分析結果

圖6 綠豆原淀粉及氧化淀粉X射線衍射圖Fig. 6 X-ray diffraction patterns of raw and oxidized mung bean starch

從圖6可以看出，綠豆原淀粉具有尖銳的峰形，在衍射角2θ分別為15°、17°、23°下有較強的衍射峰，其中2θ為17°是原淀粉最強的衍射峰，與原淀粉相比，氧化淀粉的衍射峰及位置都沒有發(fā)生改變，主要原因可能是淀粉顆粒沒有通過凝膠化破壞，反應主要發(fā)生在無定形區(qū)中，氧化劑不會滲透到淀粉顆粒中以改變晶體結構，該結果與Chávez-Murillo等[24]報道的結果一致，但與Zhang Yurong等[25]的結果不同，在其研究中，淀粉在反應前被凝膠化，以釋放直鏈淀粉和支鏈淀粉鏈中的所有羥基，當凝淀粉被過氧化氫氧化時，分子鏈隨著氧化程度的增加而解聚，進而改變了晶體結構的類型。

2.5 淀粉Zeta電位分析結果

表1 綠豆原淀粉及氧化淀粉的Zeta電位Table 1 Zeta potential of raw and oxidized mung bean starch

由表1可知，原淀粉及氧化淀粉均帶負電，與原淀粉相比，不同處理條件下淀粉的Zeta電位絕對值均增大，未超聲處理組與超聲25 kHz處理組的電位相近，是因為這兩個處理組的氧化度基本一致，而超聲45 kHz和超聲53 kHz處理組的電位絕對值較低，是因為這兩組的氧化度較低，由此可以得出，電位的高低與氧化度有很大關系，氧化度越高，羧基含量越高，溶液中的陰離子增多，導致溶液帶負電。

2.6 淀粉黏度分析結果

圖7 不同處理方式對綠豆淀粉黏度的影響Fig. 7 Effect of ultrasonic treatments on viscosity of mung bean starch

如圖7所示，淀粉經(jīng)氧化處理后其糊的黏度比原淀粉顯著降低，原淀粉的黏度為35 Pa·s，超聲53 kHz處理組的氧化度為28.49%，黏度下降為0.3 Pa·s，而當超聲頻率降低時，其黏度逐漸下降，但下降速率變得很緩慢，黏度由0.3 Pa·s降至0.04 Pa·s。

次氯酸鈉氧化淀粉黏度降低的原因是淀粉鏈氧化裂解，導致淀粉分子尺寸減小[26-27]，帶負電荷羧基的存在會削弱分子相互作用，從而降低其凝膠黏度，并且隨著氧化度的增加，氧化淀粉的直鏈淀粉含量逐漸降低，螺旋結構破裂，降低了碘與直鏈淀粉形成藍色包合物的能力；此外，直鏈淀粉的線性結構和隨機排列使其更易于氧化降解[28]。

2.7 淀粉粒徑分析結果

表2 綠豆原淀粉及氧化淀粉的粒徑Table 2 Granule size of raw and oxidized mung bean starch

從表2中可以看出，與原淀粉相比，不同處理條件下淀粉的粒徑均減小，超聲處理組的粒徑均小于未超聲處理組，超聲頻率25 kHz處理的氧化淀粉粒徑最小，以D50為例，25 kHz處理組比原淀粉減小了85.27%，超聲處理組氧化淀粉的粒徑比未超聲處理組至少減小了60.25%。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是淀粉分子在氧化劑與超聲波雙重作用下，淀粉結構出現(xiàn)部分損傷，包括孔狀、凹陷、部分剝離等，氧化劑能深入淀粉分子內(nèi)部，使部分淀粉分子發(fā)生降解，從而導致淀粉整體顆粒變小，不同頻率產(chǎn)生不同強度的空化效應，高頻時空化效應減弱，因此，低頻時淀粉顆粒具有更小的粒徑[29-30]。

2.8 淀粉透光率分析結果

圖8 不同處理方式對綠豆淀粉透光率的影響Fig. 8 Effect of ultrasonic treatments on transmittance of mung bean starch

由圖8可知，與原淀粉相比，不同處理條件下綠豆淀粉的透光率均大幅增加，未超聲氧化淀粉的透光率為98.11%，比原淀粉的透光率增加了1 870%，超聲25 kHz條件下的氧化淀粉透明度最好，比原淀粉的透光率增加了1 962%，氧化度越高，透光率越大。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是因為超聲作用促進淀粉顆粒結構被破壞[31]，氧化淀粉中特別是羧基親水基團的存在阻礙了分子的重新結合，羧基的取代與解聚結合導致氧化淀粉的糊劑透明度更高，淀粉的溶解度越大，其糊狀物就越透明[26,32]。

2.9 淀粉溶解度分析結果

由圖9可知，與原淀粉相比，不同處理條件下淀粉的溶解度均顯著增加，超聲25 kHz條件下的氧化淀粉溶解度最好。與原淀粉相比，未超聲氧化淀粉的溶解度增加了740%，超聲頻率25 kHz制備的氧化淀粉溶解度比未超聲氧化淀粉增加了4.2%，超聲45 kHz和53 kHz的溶解度與未超聲處理組的差異不顯著。氧化淀粉溶解度的增加可能是因為氧化和超聲波處理都能有效使淀粉的顆粒結構變得疏松，從而使淀粉更易溶，淀粉顆粒完整性的弱化與引入羧基后淀粉聚合物的負電荷有關[26]，氧化度越高，淀粉分子顆粒間的結合力被削弱，導致其顆粒膨脹，增加了水分子與淀粉游離羥基結合的幾率，從而使淀粉溶解度增大。

圖9 不同處理方式對綠豆淀粉溶解度的影響Fig. 9 Effect of ultrasonic treatments on solubility of mung bean starch

3 結 論

氧化淀粉制備最佳工藝條件：氧化劑與淀粉含有葡萄糖單元物質(zhì)的量比1.5∶1、反應pH 8.5～9.0左右、反應時間90 min、反應溫度10 ℃；超聲輔助處理結果表明：超聲頻率25 kHz時，淀粉氧化度最高（41%），得率為95%，低頻可以促進氧化反應的進行，高頻不利于淀粉氧化反應的進行。掃描電子顯微鏡結果顯示，氧化淀粉顆粒破碎減小，表面出現(xiàn)較多孔洞及凹陷，超聲頻率25 kHz制備的氧化淀粉顆粒明顯減小；傅里葉變換紅外光譜結果顯示，氧化淀粉在1 610 cm-1左右出現(xiàn)了明顯的羧基吸收峰，說明淀粉被成功氧化；X射線衍射結果顯示，原淀粉經(jīng)不同方式變性后，破壞程度不足以使其晶型改變；淀粉經(jīng)氧化后，一些性質(zhì)發(fā)生了極大改變，與原淀粉相比，氧化淀粉氧化度越高，黏度越低，粒徑減小，且超聲輔助使氧化淀粉具有更小的粒徑，溶解度、透光率增加，帶電荷量增加。綜上，超聲輔助成功制備了綠豆氧化淀粉，結構性質(zhì)分析表明更小的粒徑、更大的溶解度將有利于綠豆淀粉產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用。