加工工藝對茶樹花品質及抗氧化活性的影響

黃 艷，商 虎，朱嘉威，劉 鵬，孫威江,*

（1.福建農林大學安溪茶學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；3.福建省茶產業工程技術研究中心，福建 福州 350002；4.福建茶產業技術開發基地，福建 福州 350002）

茶樹花花芽從6月份開始分化，延續到11月，花期較長，盛花期集中在10月中旬到11月中旬，占年開花時間的85%以上。茶樹花內含物質豐富，具有多種對人體有益的生理活性物質，衛生部在2013年第1號公告中批準茶樹花為新資源食品，允許生產經營。茶樹花的化學組成與茶葉基本相同，對人體有延緩衰老[1]、預防癌癥[2]等功效，茶樹花可加工成茶樹花酒[3]、茶樹花護膚品[4]、食品添加劑[5]，也可以干燥成茶樹花茶直接沖泡飲用。鑒于茶樹花具有廣闊的應用前景，本實驗研究加工工藝對茶樹花茶中功能性成分含量、抗氧化活性、感官風味的影響。

目前茶樹花茶的加工工藝主要有熱風烘干[6]、微波紅外結合熱輻射干燥[7]、微波干燥[8]、真空冷凍干燥[9]等方式，相關研究側重于分析干燥工藝對茶樹花的常規成分（水浸出物、游離氨基酸總量、茶多酚總量、茶皂素、抗氧化活性）的影響，鮮有探討加工方式對茶樹花中兒茶素組分、茶沒食子素、可可堿、茶葉堿的影響。黃燕芬等[10]認為以微波殺青結合恒溫箱烘干法制作的茶樹花茶外觀和感官品質均是最好的；王振康等[11]比較微波殺青和熱力殺青對茶樹花中水浸出物、茶多酚和游離氨基酸含量的影響，認為微波殺青能保存茶多酚和氨基酸的含量；聶樟清等[12]認為殺青方式對茶樹花水溶性糖、水浸出物和感官品質影響較大，而干燥方式對生化成分影響不大；Chen Zhenchun等[13]利用超臨界二氧化碳萃取法提取的茶樹花精油表現出良好的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除能力；屠幼英[14]利用高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）技術從茶樹花乙酸乙酯層中鑒定出了8 種兒茶素，并證明其在茶樹花抗氧化活性中起主要作用。因此，本研究采用HPLC-MS技術分析炒青烘干、微波烘干、真空冷凍干燥處理下茶樹花茶常規成分、兒茶素組分、生物堿組分、酚酸組分等功能性成分的變化，比較不同工藝處理下茶樹花茶對DPPH清除能力的影響，探討成品的感官風味特征與形成原因，總結出茶樹花中的生物堿（咖啡堿、可可堿、茶葉堿）、酚酸（茶沒食子素、沒食子酸）的變化規律，以期為開發利用茶樹花資源提供有效的功能性成分數據，為茶樹花加工提供具體工藝參數，為不同風味茶樹花茶產品正式投產提供理論依據與數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以2017年10月于福建農林大學安溪茶學院科教茶園（安溪縣參內鄉）采摘的‘黃金桂’茶樹品種的半開放花苞為原料，勻堆并分成三等份。

堿式乙酸鉛、鹽酸、濃硫酸、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、茚三酮、福林-酚試劑、DPPH國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸標準品、咖啡堿標準品、可可堿標準品、茶氨酸標準品等 美國Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜級） 德國默克公司。

1.2 儀器與設備

微波爐 廣東格蘭仕公司；6CDG型鍋炒殺青機福建佳友茶葉機械公司；DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱 廈門精藝興業科技有限公司；ALPHA1-2 LD plus型真空冷凍干燥機 德國Christ公司；WK-400B型茶葉粉碎機、BSA124S型分析天平、HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 廈門精藝興業科技公司；超低溫冰箱 青島海爾公司；分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；UV-1750型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；e2695高效液相色譜儀（配有2998PDA檢測器及Enpower2分析軟件） 美國Waters公司；色譜柱Phenyl-Hexyl 100?（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國Phenomenex公司；1100高效液相色譜（配有二元泵加圖像二極管陣列檢測器） 美國Agilent公司；電噴霧HCT Ultra PTM Discovery System離子阱質譜（配有ESI Compass 1.3軟件）美國Bruker Daltonics公司。

1.3 方法

1.3.1 茶樹花前處理及加工工藝

將采摘的茶樹鮮花均勻平攤于水篩上，日光萎凋1 h后，按照1.3.1.1～1.3.1.3節的步驟分別制作鍋式殺青烘干（簡稱炒青烘干）、微波殺青烘干（簡稱微波烘干），真空冷凍干燥工藝的茶樹花茶。每個實驗重復3 次。

1.3.1.1 鍋式殺青烘干

殺青鍋預熱至220 ℃左右，投入600 g左右的茶樹花，高溫殺青5 min后，攤涼15 min，放入預熱至110 ℃烘箱烘干至水分質量分數為3%左右。

1.3.1.2 微波殺青烘干

微波爐設置高火檔，茶樹花平鋪1 cm厚度，運行50 s，翻拌，再運行50 s，攤涼15 min，放入預熱至110 ℃烘箱烘干至水分質量分數為3%左右。

1.3.1.3 真空冷凍干燥

新鮮采摘的茶樹花直接放入超低溫冰箱-20 ℃預凍結5 h，放入真空冷凍干燥機托盤中干燥，處理真空度0.001 2 mbar、溫度-50 ℃、運行時間20 h。

1.3.2 生化成分與自由基清除能力測定

1.3.2.1 常規生化成分含量測定

試樣的制備及干物質含量測定參照GB/T 8303—2013《茶 磨碎試樣的制備及其干物質含量測定》[15]；水浸出物含量測定參照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》[16]；茶多酚總量測定參照ISO 14502-1[17]；游離氨基酸總量檢測參照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》[18]。

1.3.2.2 兒茶素、酚酸、生物堿含量測定

參考ISO 14502-2[19]中的色譜法分離兒茶素、酚酸、生物堿，采用內標法定量分析沒食子酸、咖啡堿、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、(＋)-兒茶素（(＋)-catechin，(＋)-C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）含量。

沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、甲基化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（methyl-epigallocatechin gallate，methyl-EGCG）、甲基化表兒茶素沒食子酸酯（methyl-epicatechin gallate，methyl-ECG）、茶沒食子素、茶葉堿、可可堿通過核對HMDB、Metlin和MassBank數據庫并結合文獻[20-21]進行初步定性，并與標準品比對保留時間、精確質量數及碎片信息定性。

質譜條件[22]：電噴霧離子肼，負離子模式鑒定上述兒茶素組分、茶沒食子素；正離子模式鑒定茶葉堿和可可堿。全掃描模式，m/z 100～1 200；噴霧壓力60.00 psi；氣流11.00 L/min；干燥溫度365 ℃，毛細管電壓3 500 V。

1.3.2.3 DPPH自由基清除能力測定

DPPH溶液的配制：將20 mg DPPH粉末加入一定甲醇進行溶解，然后加甲醇定容至250 mL，配制成0.02 mmol/L。

配制梯度質量濃度的茶樹花提取液：根據GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，以體積分數70%甲醇溶液對茶樹花進行提取，并且用甲醇將茶樹花提取物稀釋成梯度質量濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）。

DPPH分子有一個很穩定的氮中心自由基，在517 nm波長處有強吸收，可利用紫外-可見分光光度儀測定其在517 nm波長處的吸光度。抗氧化劑茶樹花提取物提供的電子能與該自由基配對結合，特征吸收消失，因此可用于評價清除自由基的能力。分別將2 mL DPPH溶液及2 mL甲醇、2 mL DPPH溶液及2 mL茶樹花提取液、2 mL甲醇及2 mL茶樹花提取液混合，搖勻后避光靜置30 min，于517 nm波長處測定吸光度A0、As、Ar[23]。按下式計算DPPH自由基清除率。

以DPPH自由基清除率為縱坐標，茶樹花提取液的質量濃度梯度為橫坐標，繪制標準曲線，并根據標準曲線公式計算出清除率為50%時茶樹花提取液質量濃度。本實驗以抗氧化劑（茶樹花提取物）的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）表示其清除DPPH自由基能力，IC50是指能夠清除50% DPPH自由基的茶湯質量濃度，IC50越低表示其抗氧化能力越強。

1.3.3 茶樹花感官審評

根據GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》[24]中花茶的審評方法，外形得分占20%，香氣占得分35%，湯色得分占5%，滋味得分占30%，葉底得分占10%，以加權方式計算總分。

1.4 數據處理與分析

HPLC-MS數據采用ESI Compass 1.3軟件分析，HPLC數據采用Empower 3軟件分析。所有的實驗數據運用Excel軟件作圖，并通過SPSS軟件進行單因素方差分析、S-N-K檢驗、Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 干燥工藝對茶樹花內含代謝物的影響

2.1.1 干燥工藝對常規內含物的影響

為了維持花朵的外形并減少花粉裸露，茶樹花脫水過程中不施加任何壓力與揉捻工序，因此3 種工藝的水浸出物含量差異并不顯著，約為500 mg/g左右（表1）。茶樹花中茶多酚的含量根據工藝處理不同而呈現出顯著差異，真空冷凍干燥（142.8 mg/g）＞微波烘干（119.9 mg/g）＞炒青烘干（109.2 mg/g），說明真空冷凍干燥是保留茶樹花中茶多酚的最有效方法；微波烘干雖然可以短時高效破壞酶活性，防止代謝產物發生酶促氧化，但是該工藝后期物料會經歷短暫的升溫過程，這個升溫階段會部分促進茶多酚氧化，因此微波烘干處理的茶多酚含量較真空冷凍處理顯著減少；相較于微波干燥處理，炒青烘干雖然也是通過高溫鈍化酶活性，但是由于殺青鍋的金屬介質導熱效率低于微波，因此在達到酶鈍化的溫度之前，內含物質經歷了更漫長的升溫氧化過程，因此炒青烘干的茶樹花茶中茶多酚含量最低。炒青烘干和微波烘干處理并不會造成游離氨基酸含量減少，因此炒青烘干和微波烘干的茶樹花中游離氨基酸含量差異不顯著，約為15 mg/g；但是這兩種工藝后期均使用熱風干燥技術，熱風干燥會促進氨基酸與糖類化合物發生美拉德反應，因此這兩種工藝的游離氨基酸含量顯著低于真空冷凍干燥工藝。

表1 不同干燥工藝條件下茶樹花主要內含物質的含量Table 1 Contents of major components in tea plant flowers under different processing treatments

2.1.2 干燥工藝對兒茶素含量的影響

特異品種的茶樹組織器官中存在天然的甲基化兒茶素，例如methyl-EGCG和methyl-ECG。本研究通過三重四極桿質譜的碎片信息結合DAD二極管檢測器的兒茶素和甲基化兒茶素特征光譜分析，在‘黃金桂’品種茶樹花中均發現了這兩種甲基化兒茶素。HPLC分析發現，茶樹花中methyl-EGCG、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）與黃酮醇糖苷類化合物在相同的保留時間出峰，存在共析出現象，因此不予定量分析。本實驗共定性鑒定出9 種兒茶素，定量分析以下7 種兒茶素：GC、EGC、(＋)-C、EC、EGCG、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、ECG、methyl-ECG。

表2 不同干燥工藝條件對茶樹花中兒茶素的影響Table 2 Contents of cathchins in tea plant flowers under different processing treatments mg/g

研究表明加熱干燥會促進茶樹花體內兒茶素的分解與氧化[6]，體外模擬實驗表明EC和EGC在30～90 ℃下最不穩定[25]，它們與EGCG、ECG、(＋)-C氧化降解的速率從高到低依次為EGC≈EGCG＞ECG＞EC＞(＋)-C[26]。因此，真空冷凍干燥處理下，EGCG、EC、ECG、EGC含量均顯著高于微波烘干和炒青烘干（表2）。真空冷凍干燥是減少茶樹花中兒茶素降解、氧化、異構化的最有效途徑之一，干燥處理溫度越高，兒茶素的減少量越多[6]。茶樹花中含量最高的為EGC，其次為EGCG、GC、ECG、EC、(＋)-C、methyl-ECG。茶樹鮮葉中含量最高的為EGCG，其次為EGC、ECG[27]，茶樹葉片與花中雖然兒茶素的組成一致，各兒茶素占比不同，葉片以酯型兒茶素為主，花以非酯型兒茶素為主。

2.1.3 干燥工藝對酚酸和生物堿的影響

茶沒食子素屬于重要的酚酸類衍生物，其對溫度不敏感，因此3 種工藝處理下茶樹花中茶沒食子素含量差異不顯著（圖1）。沒食子酸是茶葉體內含量最高的酚酸類化合物，同時沒食子酸是酯型兒茶素降解成非酯型兒茶素的重要產物。由圖1可看出，炒青烘干和微波烘干處理的茶樹花沒食子酸含量顯著高于真空冷凍干燥，同時酯型兒茶素（ECG、EGCG）含量顯著低于真空冷凍干燥（表2），說明酯型兒茶素在熱處理過程中發生了降解并釋放出大量的沒食子酸。

圖1 不同干燥工藝條件下茶沒食子素和沒食子酸含量Fig. 1 Contents of theogallin and gallic acid in tea plant flowers under different processing treatments

圖2 不同干燥工藝條件下生物堿含量Fig. 2 Contents of alkaloids in tea plant flowers under different processing treatments

咖啡堿、可可堿和茶葉堿是茶樹中重要的生物堿，咖啡堿存在所有的茶樹體內，而可可堿和茶葉堿僅特異性存在于部分茶樹品種中。本研究發現‘黃金桂’品種的茶樹花中同時含有這3 種生物堿（圖2）。茶樹花中含量最高的是咖啡堿（10.7～11.1 mg/g），可可堿（1.3～1.5 mg/g）和茶葉堿（1.3～1.4 mg/g）含量明顯低于咖啡堿。在這3 種工藝處理下咖啡堿穩定存在，未發生明顯變化。真空冷凍干燥處理的茶樹花中可可堿含量顯著高于其他2 組處理；微波烘干處理的茶葉堿含量與炒青烘干處理、真空冷凍干燥處理差異均不顯著。整體而言，與兒茶素、沒食子酸相比，不同干燥工藝處理下茶樹花的生物堿相對穩定存在。

2.2 干燥工藝對茶樹花DPPH自由基清除能力的影響

不同干燥工藝處理后茶樹花DPPH自由基清除能力的IC50差異均達到顯著水平（表3）。IC50越低表示其抗氧化能力越強。對DPPH自由基清除作用強弱依次為真空冷凍干燥＞微波烘干＞炒青烘干，IC50與2.1.1節中茶多酚含量呈顯著負相關（r＝-0.942），茶多酚含量越高，IC50越低，自由基清除能力越強。這說明低溫冷凍過程中，多元酚類化合物的氧化受到抑制，兒茶素組分最接近原始狀態。多酚類化合物具有抗氧化活性，因此其含量與DPPH自由基清除作用的IC50成反比。

表3 不同干燥工藝茶樹花的茶湯濃度對DPPH自由基清除能力的標準曲線與IC50Table 3 Standard curves and half maximal inhibitory concentration for DPPH radical scavenging capacity of tea plant flowers under different processing treatments

2.3 干燥工藝對茶樹花感官風味的影響

通過感官審評發現，這3 種干燥工藝條件下，成品茶樹花茶均帶有麻澀的滋味；但是3 種處理下，風味品質又各有特征（表4）。真空冷凍干燥完整地保留了茶樹花的外形和香氣，由于未經過高溫殺青處理，滋味不及其他兩種干燥工藝濃醇，同時香氣中帶有青氣。而炒青烘干和微波烘干處理后的茶樹花茶均帶有甜玉米香氣，而且炒青的香氣更濃郁。研究中發現茶樹花在熱干燥處理后呈現出玉米香，這可能是‘黃金桂’品種茶樹花所具有的特征香氣，并且需要熱處理來激發誘導產生這種甜玉米香，因此真空冷凍干燥處理無法產生這種香型。

3 討 論

3.1 茶樹花的代謝產物豐富

花作為植物的生殖器官，包含了豐富的次級代謝產物。茶樹花不僅含有豐富的兒茶素、茶沒食子素、咖啡堿等，也在特定的品種‘黃金桂’中發現了稀有的可可堿和茶葉堿。實驗也直接證明茶樹花具有DPPH自由基清除能力。另外，茶樹花中富含的抗氧化酶例如多酚氧化酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶的均對人體有很好的保健功效，EGCG等酯型兒茶素和EGC等非酯型兒茶素也被證明具有優異的保健性能[28]。實驗證明兒茶素等物質容易受到加熱作用而氧化降解，因此，最大限度地保留功能性化合物的活性是加工過程中必須衡量的問題之一。前人的研究與本研究共同證明了相比較熱處理的方式，真空冷凍干燥是保持茶樹花中功能性化合物活性的最有效方法。

3.2 茶樹花茶的感官風味

大量研究證明茶樹花茶的保健功效、感官風味仍是其作為食品的關鍵考核因子。冷凍干燥雖然能保存功能性成分，但是由于沒有經過高溫殺青處理，成品帶有青氣；不論使用何種加工方式，茶樹花茶按照感官審評方式沖泡，滋味總是會麻舌澀口，這在其他研究[9]中也有報道。澀口的不足應該從泡飲方式上進行優化，這需要后續設計沖泡實驗來解決。相比較于滋味的不足，烘干的茶樹花茶香氣甜香濃郁似玉米香，凍干的茶樹花有青花香，其各有特色。所以在沖泡時科學地揚長避短，才能夠讓大眾接受這款新飲品。

殺青烘干和微波烘干處理茶樹花的水煮玉米香，是茶樹原料加工成產品后罕見的香型，而且僅發生在高溫熱處理的樣品中。其他食品也發現了這種現象，高溫熱脫水處理（溫度高于80 ℃）的食品呈現類似玉米香。例如與鹽水鴨、水煮鴨相比，烤鴨中未氧化的鴨脂具有較高的甜玉米氣味[29]；高壓蒸煮后熱脫水干燥的即食型扇貝柱在貯藏早期通過定量描述法得到地氣味描述詞為甜味、煮玉米味[30]，這個時期的揮發性成分為硫醚類[31]；意面脫水干燥過程中采用最高溫度82 ℃時也表現出高品質的玉米香[32]。這些研究用詳實的數據指出二甲硫（醚）是關鍵的呈香因子。高溫脫水處理產生的二甲硫被認為是還原糖與甲硫氨酸（蛋氨酸）發生美拉德反應的產物[33]。二甲硫（醚）在茶葉，特別是在烘炒的綠茶中也有發現，茶葉風味化學描述其為“新茶香”。茶樹花在花瓣露白和完全展開時期均未檢測到二甲硫（醚）[34]，推斷由于茶樹花蛋白質與還原糖含量顯著高于葉片，因此二甲硫（醚）在熱脫水過程中大量富集而形成玉米香，本研究后續也會開展相關工作驗證這個結論。

表4 不同干燥工藝的茶樹花感官特征Table 4 Sensory profiles of tea plant flowers under different processing treatments

3.3 開發茶樹花茶的產業效益

開發茶樹花產品意義重大。以產茶大縣安溪為例，截至2018年底，該縣茶園面積60萬 hm2，以畝產100 kg茶樹花計算，全縣可生產茶樹花茶1.5萬 t。茶樹花的飲用及活性物質利用不僅能夠實現資源利用，還能夠改變單一的茶葉生產模式，延伸當地上游茶產業鏈，具有經濟效益和社會效益。10月中旬至11月中旬是茶樹花的盛花期，而這個時期安溪茶農處于農閑時期，通過采收茶花，既減少茶樹的營養消耗，又能帶來可觀的經濟效益。因此，本研究作為開發利用安溪當地茶樹干花制品的基礎性研究，希望能夠促進安溪當地茶樹花資源的開發和利用，為其開發茶樹花產品提供理論依據和數據參考。