樺木酸對T-2毒素致小鼠腸道氧化損傷的保護作用

黃城龍，朱利娟，易想煉，黃 琳，歐朝萍，馬玉容，鄔 靜,2,3，李榮芳,2,3,*，易金娥,2,3,*

（1.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128；2.湖南畜禽安全生產協同創新中心，湖南 長沙 410128；3.畜禽保健湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410128）

真菌毒素是由真菌產生的次生代謝產物，目前已確認的約有300多種霉菌代謝產物僅對人和動物有毒[1]。據估計，全球約25%的農產品在一定程度上受到霉菌毒素的污染[2]，而單端孢霉烯族毒素是農業上對全球健康構成潛在危害的最重要的真菌毒素之一[1]。早在1973年聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織就將單端孢霉烯族毒素列為最危險的天然存在的食品污染毒物之一。單端孢霉烯族真菌毒素從結構上可分為A、B、C、D 4 種類型[3]，B類最常見，且結構復雜，通常稱為大環單族毒素。而A類結構比較簡單，為非大環類，通常由鐮孢菌產生。在動物體內，A類單端孢霉烯族真菌毒素的毒性為B類的10～100 倍，而T-2毒素屬于A類單端孢霉烯族，是此類毒素中急性毒性最強的毒素[4]。T-2毒素廣泛分布在小麥、大麥、燕麥、玉米、谷物以及動物飼料中，其性質穩定，難以清除，對機體免疫系統、消化系統、神經系統等都有較強的損害作用[5-6]。研究報道，T-2毒素能夠降低腸上皮細胞的存活率[7]，從而損害腸道屏障，造成動物和人類的腸道疾病[8]。近年來大量研究表明，機體產生氧化應激是T-2毒素毒性作用發揮的基本機制之一[9]。據報道，4.8 mg/kg mbT-2毒素能誘導蝦明顯的氧化損傷[10]，4 mg/kg mbT-2毒素能廣泛引起大鼠肝臟、脾臟、胸腺和胃組織氧化損傷[11]。

氧化損傷與許多人類疾病密切相關。事實上，許多疾病的病理基礎都是氧化損傷[12]。在所有完全分化的器官中，由于腸細胞更新頻繁，不斷暴露于外源性物質中，腸組織比其他器官更容易受到氧化損傷[13]。越來越多的證據表明，各種腸道疾病，甚至它們的致病因素，都與氧化損傷有關。因此，尋找一種天然有效的抗氧化劑，對于維護腸道健康和預防疾病的發生具有重要意義。

樺木酸（betulinic acid，BA）是一種來源于羽扇豆的三萜化合物，廣泛存在于食品、水果、蔬菜和植物中。BA是一種具有多種生物學活性的天然活性物質，如抗氧化應激、抗炎、提高機體免疫力、抗腫瘤、抗瘧疾以及抗艾滋病毒等。本課題組對BA的免疫調控和抗氧化作用開展了大量的研究工作，發現BA能夠緩解酒精性肝損傷[3]，調控地塞米松誘導的淋巴細胞凋亡[14]，減輕環磷酰胺造成的腸道氧化損傷[15]，這些保護作用都與BA的抗氧化能力有關。那么，對于霉菌毒素造成的腸道氧化損傷，BA是否同樣具有預防性保護作用？對此目前鮮有報道。因此，本實驗通過給小鼠進行T-2毒素攻毒建立腸道氧化損傷模型，研究BA對機體的體液免疫、腸道黏膜屏障功能以及抗氧化能力的影響，為BA的抗氧化作用以及功能性食品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性KM小鼠60 只，體質量（20±2）g，4～5 周，購于湖南斯萊克景達實驗動物公司（生產許可證號SCXK（湘）2009-0004），使用M02小鼠普通飼料飼喂。

T-2毒素 新加坡Pribolab公司；BA 美國Sigma公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色液 武漢谷歌生物科技有限公司；免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、IgM、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒武漢華美生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

JXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨儀 上海凈信實業發展有限公司；Infinite 200 PRO多功能酶標儀美國BioTek公司；AFX1-0501-P超純水儀 臺灣艾科浦公司；5404EQ220531高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；超薄切片機 德國Leica公司；U410-86 超低溫冰箱 英國New Brunswick Scientific公司；AY220電子天平 日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組與給藥

BA和T-2毒素的劑量根據前期研究以及預實驗來確定[3,14]，VE作為陽性對照組[16]。將健康雄性KM小鼠置于室溫（22～25 ℃）、相對濕度為50%～70%的動物飼養室中適應性飼養1 周后，隨機分為6 組（n＝10），分別為對照組，T-2毒素組，BA低、中、高劑量組（0.25、0.5、1 mg/kg mbBA+T-2毒素），VE組（100 mg/kg mbVE+T-2毒素）。將BA與VE混懸于質量分數1%的可溶性淀粉中進行灌胃，1 次/d，連續灌胃14 d，對照組和T-2毒素組灌服可溶性淀粉。最后一次灌胃10 h后，除空白對照組注射等量乙醇＋磷酸鹽緩沖液混合液外，其余各組將T-2毒素溶于磷酸鹽緩沖液與乙醇溶液，腹腔注射4 mg/kg mbT-2毒素，建立腸道氧化損傷模型。

1.3.2 樣本采集與相關指標檢測

小鼠自由飲水，禁食15 h后，眼球采血，3 000 r/min離心15 min，收集血清，用ELISA法檢測IgG、IgM、DAO水平；取小腸組織（十二指腸、空腸和回腸）于生理鹽水中輕輕晃動除凈腸道內容物，其中將一部分空腸固定于福爾馬林中，用于H & E染色觀察腸道形態結構的改變，剩余十二指腸、空腸和回腸部分制成10%組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測CAT、GSH-Px、MDA、GSH等氧化指標水平和各組織蛋白濃度。

1.4 數據分析與處理

所測數據采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，數據分析采用單因素方差法，兩兩比較采用q檢驗，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 BA對T-2毒素致小鼠血清IgG和IgM水平的影響

機體的免疫系統對維持機體的健康至關重要。IgG是機體體液免疫的重要指標，具有抗菌和中和病毒的作用。在原發性免疫應答中，大多數Ig屬于IgM類，在宿主對抗病原體的前線防御中起著至關重要的作用[17]。它們能引起可溶性抗原的沉積，從而提高免疫系統通過吞噬作用消除抗原的能力，保護機體免受感染和損傷。

圖1 BA對T-2毒素致小鼠血清IgG（A）和IgM（B）水平的影響Fig. 1 Effect of BA on IgG (A) and IgM (B) levels in serum of mice treated with T-2 toxin

如圖1所示，與對照組相比，T-2毒素降低了小鼠血清中IgM質量濃度（P＞0.05）；與T-2毒素組相比，中、高劑量的BA預處理顯著升高了血清中IgG和IgM質量濃度（P＜0.01，P＜0.05）；同樣VE預處理顯著升高血清中IgG和IgM質量濃度（P＜0.05）。說明BA和VE都能夠提高小鼠的機體免疫力。

2.2 BA對T-2毒素致小鼠血清DAO活力的影響

圖2 BA對T-2毒素致小鼠血清DAO活力的影響Fig. 2 Effect of BA on DAO activity in serum of mice treated with T-2 toxin

DAO是由小腸上皮細胞產生的一種胞內酶，血清DAO的水平與腸屏障損傷和修復密切相關[18-20]。如圖2所示，與對照組相比，T-2毒素升高了血清中DAO活力（P＞0.05）。與T-2毒素組相比，各劑量組BA均降低了血清DAO的活力，其中高劑量組差異極顯著（P＜0.01）；VE組預處理后極顯著降低了血清中DAO的活力（P＜0.01）。這說明了BA和VE都能夠改善小鼠腸道的屏障功能。

2.3 BA對T-2毒素致小腸CAT活力的影響

CAT是機體抵抗氧化應激的第一道防線，能夠催化無機過氧化物H2O2發生水解，從而保護機體不被自由基侵害。由圖3可知，與對照組相比，T-2毒素組顯著或極顯著降低十二指腸、空腸和回腸CAT活性（P＜0.01，P＜0.05）；與T-2毒素組相比，BA各劑量組均顯著或極顯著增強十二指腸、空腸和回腸CAT活性（P＜0.01，P＜0.05），VE組能顯著增強十二指腸、空腸和回腸CAT活性（P＜0.05）。

圖3 BA對T-2毒素致小鼠十二指腸（A）、空腸（B）和回腸（C）CAT活力的影響Fig. 3 Effect of BA on CAT activity in duodenum (A), jejunum (B) and ileum (C) of mice treated with T-2 toxin

2.4 BA對T-2毒素致小鼠小腸GSH-Px活力的影響

圖4 BA對T-2毒素致小鼠十二指腸（A）、空腸（B）和回腸（C）GSH-Px活力的影響Fig. 4 Effect of BA on GSH-Px activity in duodenum (A), jejunum (B)and ileum (C) of mice treated with T-2 toxin

GSH-Px是機體重要的抗氧化酶，能夠保護細胞膜免受脂質過氧化。由圖4可知，與對照組相比，T-2毒素組顯著降低十二指腸和空腸GSH-Px活性（P＜0.05）；BA預處理后，極顯著增強十二指腸和空腸GSH-Px活性（P＜0.01），中劑量的BA極顯著增強回腸GSH-Px活性（P＜0.01），VE極顯著升高十二指腸和空腸GSH-Px活性（P＜0.01）。

2.5 BA對T-2毒素致小鼠小腸MDA含量的影響

圖5 BA對T-2毒素致小鼠十二指腸（A）、空腸（B）和回腸（C）MDA含量的影響Fig. 5 Effect of BA on MDA contents in duodenum (A), jejunum (B)and ileum (C) of mice treated with T-2 toxin

MDA是脂質過氧化的主要終產物，被認為是氧化損傷的生物標志物。由圖5可知，T-2毒素顯著或極顯著升高了十二指腸、空腸和回腸MDA含量（P＜0.01，P＜0.05）；與T-2毒素組相比，BA各劑量組極顯著降低十二指腸和空腸MDA含量（P＜0.01），低和中劑量的BA極顯著降低回腸MDA含量（P＜0.01），同樣，VE顯著或極顯著降低各腸段MDA含量（P＜0.01，P＜0.05）。

2.6 BA對T-2毒素致小腸GSH含量的影響

GSH作為GSH-Px的輔助因子，在機體抗氧化防御系統中同樣發揮著重要作用。由圖6可知，與對照組相比，T-2毒素組極顯著降低了空腸GSH含量（P＜0.01）；與T-2毒素組相比，BA各組能提高各腸段GSH水平，以空腸差異極顯著（P＜0.01），VE也能極顯著提高空腸GSH含量（P＜0.01）。

圖6 BA對T-2毒素致小鼠十二指腸（A）、空腸（B）和回腸（C）GSH含量的影響Fig. 6 Effect of BA on GSH contents in duodenum (A), jejunum (B)and ileum (C) of mice treated with T-2 toxin

2.7 BA對T-2毒素致小鼠空腸形態的影響

圖7 H & E染色觀察BA對T-2毒素致小鼠空腸形態結構的影響（100×）Fig. 7 Effect of BA on intestinal morphological structure in mice treated with T-2 toxin evaluated by H & E staining (100 ×)

如圖7所示，對照組小鼠腸絨毛形態結構正常（圖7A）；T-2毒素引起腸絨毛排列不整齊，腸絨毛變短，不同程度斷裂或溶解，腸絨毛間松散，隱窩加深等現象（圖7B）；BA預處理后，能改善腸絨毛的形態結構，腸絨毛相對較長，排列較規則，絨毛間隙相對較緊湊（圖7C～E），VE預處理同樣改善腸絨毛形態結構（圖7F）。

3 討 論

腸道的健康對于機體的健康至關重要，食物的攝取和消化、營養物質的吸收都要通過腸道組織，又因為腸道使機體與外界直接相接觸，極其容易受到微生物的侵染，所以腸道也是機體最易發生氧化損傷的場所之一。血清免疫球蛋白能通過與抗原結合達到清除病原體、中和毒素和增強超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性而發揮抗衰老作用，是免疫系統的重要組成部分，其含量一定程度上反映了機體免疫功能的強弱[21]。血清中IgA、IgG和IgM是免疫反應中常見的免疫球蛋白，是機體體液免疫的分子基礎，發揮著特異性免疫作用，起著免疫防護作用。IgG是人體內含量最多的免疫球蛋白，是免疫的主力軍，IgM不能通過血管壁，多存在于血液中，是初次免疫應答反應中出現最早的抗體，被稱為免疫反應的先頭部隊[22]。當機體受到外界抗原物質刺激時，機體會產生大量的免疫球蛋白，如IgG、IgM、IgA等，迅速招募具有吞噬功能的先天性免疫細胞（粒細胞、單核細胞），激活炎癥反應，保護機體免受損傷[23-24]。大量研究證明，T-2毒素廣泛分布于自然界中，與人類日常生活密切相關，對人類和動物健康有很大潛在危害性，特別是在消化系統、神經系統和生殖系統方面危害性極大[25]。在本研究中，T-2毒素處理后，小鼠血清中IgM水平下降；而BA預處理后，中、高劑量組均顯著提高了血清IgG、IgM水平，這表明BA可能通過提高機體體液免疫能力來保護腸道的健康。DAO是一種細胞內酶，在小腸絨毛頂端的腸細胞中尤為豐富，故其在小腸中活性最高。而在正常機體血清中其活性都很低，當腸黏膜細胞壞死或腸黏膜屏障功能衰竭時，會造成腸絨毛損傷脫落，從而進入血液中，使其在血液中的活性升高。因此，血液中DAO的活性變化能夠很好地反映腸道黏膜的損傷程度[26]。本實驗中，T-2毒素組血清中DAO活性的變化差異不顯著，但表現出升高的趨勢。結合腸道組織病理學結構的結果發現，在T-2造模組引起腸絨毛排列不整齊，腸絨毛變短，不同程度斷裂或溶解，腸絨毛間松散，隱窩加深等現象，這也進一步驗證T-2毒素在一定程度上破壞了腸黏膜的完整性，造成腸道黏膜損傷，腸絨毛斷裂，進而誘發腸道黏膜屏障功能障礙。而BA預處理后能改善腸絨毛的形態結構，緩解腸絨毛縮短，使其恢復規則的排列，同時BA還能提高T-2誘導小鼠血清中DAO的活性，其中BA高劑量組差異極顯著。這說明BA可緩解T-2誘導腸黏膜結構的破壞，有效地降低腸黏膜的通透性，具有預防性保護腸道黏膜損傷，增強腸道屏障功能的作用。

在正常的生理狀態下，動物體內的抗氧化防御和促氧化作用處于動態平衡狀態。如果失衡會導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）和自由基含量的升高，引起氧化應激[27-28]。當體內ROS和自由基的產生超過了腸道組織的抗氧化防御系統的能力就會造成腸道組織氧化損傷，導致蛋白質修飾和脂質過氧化，進而引起腸道組織功能障礙和疾病的產生[29]。因此，機體只有通過加強合成抗氧化酶和修復生理系統來應對氧化應激。正常腸黏膜具有高效的抗氧化防御系統，包括SOD、CAT和GSH-Px等酶，以及GSH和金屬硫蛋白等非酶類小分子[30]。SOD通過催化超氧陰離子生成過氧化氫（H2O2）；CAT和GSH-Px具有及時消除歧化反應產生的自由基，分解其他過氧化物的作用，能夠將H2O2轉化成水。GSH為衡量氧化應激標志性指標，對機體抗氧化能力同樣發揮著重要作用[31]。當機體受到環境毒素的侵害，處于氧化應激狀態時，CAT和GSH-Px的酶活性會降低，GSH含量會減少，MDA含量會升高[32-34]。Chaudhari等[10]報道T-2毒素可以刺激細胞產生大量的ROS，從而誘發氧化應激，造成細胞損傷。本研究結果與其一致，在T-2毒素作用下，小鼠小腸各腸段（十二指腸、空腸和回腸）的CAT、GSH-Px活性均下降，GSH含量均減少，MDA含量均升高，這說明T-2毒素誘發小鼠腸道發生脂質過氧化，產生了氧化應激反應，腸道氧化損傷模型構建成功。本實驗用BA進行預處理，能夠緩解T-2毒素引起的腸道CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性的下降，提高腸道GSH水平，降低MDA含量，這說明BA通過提高腸道抗氧化能力對腸道氧化損傷起到預防性保護作用。這與前期研究結果一致，BA通過提高機體抗氧化能力減緩地塞米松或環磷酰胺致淋巴細胞氧化損傷[14-15,32-33]。本實驗中還發現，BA對十二指腸、空腸和回腸3個腸段的氧化損傷具有保護作用，其中BA預處理恢復空腸抗氧化防御和促氧化作用系統的平衡較為明顯，這可能與空腸的結構和功能有關，空腸是小腸中最長的一段，空腸各種消化酶活性均較高，是營養物質消化的主要部位，而影響消化酶活性的物質也影響抗氧化指標[35-36]，所以BA可能有選擇性地提高空腸抗氧化酶的活性，降低MDA的含量。具體機制需要進一步探究。

4 結 論

BA可以通過提高小鼠血清IgG、IgM水平，提高機體體液免疫功能，通過減少血清DAO活性，緩解腸道結構的破壞，從而增強腸黏膜屏障功能，同時通過提高小腸各腸段的CAT、GSH-Px、GSH水平、降低MDA含量來提高腸道抗氧化能力，對T-2毒素引起的小鼠腸黏膜氧化損傷起到預防性的保護作用。