快速制備鼻腔給予LPS誘導(dǎo)帕金森病動物模型及評價①

宋國斌 席國萍 李艷花 尉杰忠 劉春云 李凱軍 柴 智 馬媛媛 肖保國 張光先 馬存根

(山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所,神經(jīng)炎癥變性疾病基礎(chǔ)與應(yīng)用研究山西省重點實驗室，大同 037009)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)又名震顫麻痹，是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性、缺失，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)以α-突觸核蛋白為主要成分的嗜酸性路易小體(lewy body，LB)的形成及黑質(zhì)-紋狀體通路以多巴胺(dopamine，DA)為代表的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少[1-4]。研究表明，炎癥在PD的發(fā)病中起重要作用，腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞(microglia，MG)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與PD存在重要聯(lián)系[5-8]。脂多糖(lipopolysa-ccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，可通過激活MG來刺激機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[9,10]。研究顯示，LPS可通過黑質(zhì)內(nèi)注射、蒼白球注射、紋狀體注射和腹腔注射等途經(jīng)引起黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失，制備PD動物模型[11,12]。LPS經(jīng)鼻腔途徑給予可誘導(dǎo)PD動物模型，但需時5個月[13]。本研究通過LPS經(jīng)鼻腔小劑量、多次給藥的方式，以期加快PD動物模型的制備，縮短PD發(fā)病機制及治療效果的研究周期。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級健康雄性C57BL/6小鼠18只，6～7月齡，體質(zhì)量30～33 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(動物實驗遵照山西大同大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查委員會規(guī)定執(zhí)行)。

1.1.2藥物及試劑 LPS(Sigma公司)；兔抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體(EMD Millipore公司)；兔抗α-突觸核蛋白抗體、二抗Anti-rabbit IgG Alexa Flour 488(Cell Signaling Technology公司)；二抗HPR-goat anti-rabbit IgG(EARTH公司)；顯影液ECL(Life Sciences公司)；辛基磺酸鈉(octanesulfonic acid sodium salt，OSA)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、腎上腺素(epinephrine，E)標(biāo)準(zhǔn)品、DA標(biāo)準(zhǔn)品、3,4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)標(biāo)準(zhǔn)品、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)標(biāo)準(zhǔn)品、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)標(biāo)準(zhǔn)品、高香草酸(homovanillic acid，HVA)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；OCT(Sakura Finetek公司)，NaH2PO4、乙二胺四乙酸二鈉(Na2·EDTA)、檸檬酸、磷酸和高氯酸均為市售分析純。

1.1.3儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(Agilent公司)；色譜柱Acclaim C18 column(2.2 μmol/L,2.1 × 100 mm)、酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)；正置熒光顯微鏡(Olympus公司)；Bio-Rad凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司)；冰凍切片機(Leica公司)。

1.2方法

1.2.1動物處理與分組 小鼠單籠飼養(yǎng)，18～22℃自由飲食，并保持12 h/12 h晝夜循環(huán)，隨機分為對照組和LPS模型組，每組9只。

1.2.2動物模型制備 LPS模型組小鼠鼻腔滴入LPS(3 mg/kg，生理鹽水溶解)。滴入前先將小鼠用乙醚麻醉，保持小鼠頭后仰，緩慢滴入LPS，保持后仰狀態(tài)10～15 s，使LPS充分吸收。每側(cè)鼻孔滴10 μl，1次/3 d，對照組鼻腔滴入等體積生理鹽水，給藥7周，共給藥16次。

1.2.3行為學(xué)檢測

1.2.3.1懸絲實驗 參考文獻[14-16]，長100 cm的金屬絲水平固定于距離地面50 cm，小鼠兩前爪抓住金屬絲中心位置，按以下標(biāo)準(zhǔn)評分，評分越低代表小鼠肢體協(xié)調(diào)能力越差。①小鼠后爪抓住金屬絲的時間評分：0～4 s、5～9 s、10～19 s、20～39 s、≥40 s 分別記5分、4分、3分、2分、1分；②小鼠爬到金屬絲任意一端的時間評分：0～39 s、40～59 s、60～99 s、100～129 s、≥130 s分別記5分、4分、3分、2分、1分；③小鼠從金屬絲掉下的時間評分：沒有掉下、≥120 s掉下、60～119 s掉下、20～59 s掉下、<20 s掉下分別記5分、4分、3分、2分、1分。實驗前訓(xùn)練5次，測3次，統(tǒng)計累積臨床評分。

1.2.3.2爬桿實驗 直角三角形裝置，斜邊為直徑2 cm、長80 cm的圓形木桿，纏雙層紗布，在斜邊頂端固定一方形木塊(以剛好容納小鼠為標(biāo)準(zhǔn))，斜邊底端為平臺。將小鼠置于斜邊頂端，分別記錄小鼠轉(zhuǎn)頭時間和小鼠爬到平臺的時間。實驗前訓(xùn)練5次，測3次，統(tǒng)計轉(zhuǎn)頭時間和爬到平臺時間。

1.2.3.3步距實驗 長50 cm、寬2.5 cm、高 20 cm的單向通道作為步距實驗裝置，通道底部鋪白色硬紙，將小鼠的兩后腳掌分別涂抹紅藍墨汁，放于通道入口，出口處設(shè)置暗室。實驗前訓(xùn)練5次，測3次，統(tǒng)計通過通道的平均時間和平均步長。

1.2.3.4曠場實驗 直徑60 cm、高60 cm的圓形裝置，設(shè)定外墻區(qū)、過渡區(qū)、內(nèi)部中心區(qū)。通過電子成像系統(tǒng)記錄并統(tǒng)計小鼠5 min內(nèi)的運動距離、平均速度和休息時間[17]。

1.2.4標(biāo)本采集 行為學(xué)實驗之后，小鼠腹腔注射50 mg/L水合氯醛0.2 ml麻醉，生理鹽水灌流。每組選6只小鼠左半腦黑質(zhì)制備蛋白質(zhì)勻漿，-80℃保存用于Western blot檢測；右半腦黑質(zhì)加入0.4 mol/L高氯酸溶液，超聲勻漿、離心、制成單胺類神經(jīng)遞質(zhì)樣品液；每組剩余3只小鼠用4%多聚甲醛灌注固定，10%、20%、30%蔗糖溶液脫水，OCT包埋，小鼠黑質(zhì)區(qū)冰凍切片140張(10 μm/片)，用于免疫熒光染色。

1.2.5免疫熒光染色檢測小鼠黑質(zhì)區(qū)TH+多巴胺能神經(jīng)元 取黑質(zhì)區(qū)冰凍切片7張(編號分別為20、40、60、80、100、120、140)，PBS洗3次，每次5 min，1% BSA-PBS溶液稀釋抗TH一抗(1∶100)，4℃孵育過夜；PBS洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)種屬的二抗，室溫避光孵育2 h，PBS洗3次，50%甘油封片。Olympus正置熒光顯微鏡觀察抗體免疫染色活性并拍片。

1.2.6Western blot檢測小鼠黑質(zhì)區(qū)TH和α-突觸核蛋白表達 黑質(zhì)蛋白質(zhì)勻漿濃度調(diào)成10 g/L，上樣50 μg，SDS-PAGE垂直電泳1.5～2.0 h。 200 mA，1.5 h轉(zhuǎn)PVDF膜，抗TH一抗、抗α-突觸核蛋白一抗，4℃孵育過夜，TBST(含0.3%吐溫的PBS溶液)洗 3次，每次5 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次,ECL顯影，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀采集信號，Image lab 5.2進行圖像灰度分析。

1.2.7HPLC檢測小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)含量 稱取標(biāo)準(zhǔn)品NE 1.25 mg，E 1.56 mg，DOPAC 1.78 mg，DA 1.03 mg，5-HT 1.34 mg，5-HIAA 1.46 mg和HVA 1.03 mg分別溶于0.1 mol/L高氯酸，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，-20℃保存，使用時稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件：流動相：NaH2PO4(90 mmol/L)、檸檬酸(50 mmol/L)、OSA(1.7 mmol/L)、Na2·EDTA(25 μmol/L)、5%乙腈(V/V)混合液,0.22 μmol/L微孔濾膜過濾；流速0.2 ml/min；進樣量10 μl；柱溫40℃；Antec電化學(xué)檢測器，電壓0.7 V，靈敏度為50 nA。

2 結(jié)果

2.1鼻腔給予LPS導(dǎo)致小鼠肢體協(xié)調(diào)能力降低 鼻腔給予LPS第3周開始，通過懸絲實驗累積評分評估小鼠肢體協(xié)調(diào)能力。實驗結(jié)果顯示：3～7周，對照組小鼠懸絲實驗累積評分處于相對穩(wěn)定水平，LPS模型組隨給藥時間延長，累積評分逐漸降低，4～5周緩慢降低，6～7周急劇降低(P<0.001，圖1)。給藥7周后，LPS模型組累積評分(9.57±1.98)較對照組(12.38±1.53)顯著降低。

2.2鼻腔給予LPS導(dǎo)致小鼠運動能力減弱 懸絲實驗表明，給藥7周后，與對照組相比，LPS模型組肢體協(xié)調(diào)能力明顯減弱。爬桿實驗中，LPS模型組小鼠轉(zhuǎn)頭時間較對照組明顯延長(P<0.001)，到達平臺時間較對照組明顯延長(P<0.001)。步距實驗中，LPS模型組小鼠平均步長較對照組明顯縮短(P<0.001)，通過通道的時間較對照組明顯增加(P<0.001)。曠場實驗中，LPS模型組小鼠總運動距離較對照組明顯減少(P<0.01)，平均速度較對照組明顯減慢(P<0.001)，休息時間較對照組明顯增加(P<0.01，圖2)。

2.3鼻腔給予LPS誘導(dǎo)黑質(zhì)區(qū)TH神經(jīng)元變性缺失 黑質(zhì)區(qū)TH免疫熒光染色結(jié)果表明，與對照組比較，LPS模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量較少(P<0.05，圖3)。

2.4鼻腔給予LPS誘導(dǎo)黑質(zhì)區(qū)TH表達減少及α-突觸核蛋白表達增加 與對照組比較，LPS模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶表達減少(P<0.05)，與對照組比較，α-突觸核蛋白表達增加(P<0.05，圖4)。

2.5鼻腔給予LPS誘導(dǎo)黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物減少 與對照組相比，LPS模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)DA濃度降低(P<0.05)，DOPAC濃度降低(P<0.05)，HVA濃度降低(P<0.05)，NE濃度降低(P<0.05)，5-HT濃度降低(P<0.05)，5-HIAA濃度降低(P<0.05,圖5)。

圖1 小鼠肢體協(xié)調(diào)能力比較(0～7周) Fig.1 Comparison of body coordination ability of mice(0-7 weeks)Note: Compared with control group，***. P<0.001.

圖2 小鼠運動功能比較Fig.2 Comparison of motor function of miceNote: Compared with control group,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 小鼠黑質(zhì)區(qū)TH+多巴胺能神經(jīng)元比較Fig.3 Comparison of TH+ dopaminergic neurons in substantia nigra of miceNote: Compared with control group，*.P<0.05.

圖4 小鼠黑質(zhì)區(qū)TH和α-突觸核蛋白比較Fig.4 Comparison of TH and α-synuclein in substantia nigra of miceNote: Compared with control group，*.P<0.05.

圖5 小鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)比較Fig.5 Comparison of neurotransmitters in substantia nigra of miceNote: Compared with control group，*.P<0.05.

3 討論

目前，常用的PD動物模型主要是通過神經(jīng)毒素(如6-羥基多巴胺、MPTP、魚藤酮等)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒素模型，給藥方式通常為腹腔注射、皮下注射或腦內(nèi)定點注射，但具有局限性，如6-羥多巴胺不能通過血腦屏障，腦內(nèi)定點注射對腦部產(chǎn)生機械性損害，MPTP本身自然界不存在，且多為急性或亞急性模型，不能模擬PD漸進性發(fā)病特點，魚藤酮模型對不同動物個體制備效果不一，重復(fù)性差。為深入研究PD的發(fā)病機制和治療方法、改善PD患者的生活質(zhì)量，構(gòu)建能模擬PD漸進性發(fā)病過程、行為學(xué)特征、病理學(xué)特征的理想動物模型尤為重要[13,18-20]。

環(huán)境因素作為PD誘因之一，其機制可能是環(huán)境毒物通過口服或鼻腔暴露[13]。LPS在自然界廣泛存在，可見于空氣塵埃、大氣污染源所含的細顆粒物，故人類經(jīng)常暴露在LPS中，可經(jīng)鼻直接進入腦內(nèi)[21-23]。而作為內(nèi)毒素的LPS，雖然對神經(jīng)元無直接毒性，但可激活腦內(nèi)MG，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，釋放大量的細胞炎癥因子(TNF-α、IL-1β等)和神經(jīng)毒性因子(ROS、RNS等)，導(dǎo)致黑質(zhì)-紋狀體通路損壞，出現(xiàn)PD癥狀[24-27]。研究顯示，腦內(nèi)注射大劑量LPS，可迅速激活MG，通過炎癥反應(yīng)介導(dǎo)PD發(fā)生，但立體定向注射難度大且大劑量注射不符合PD發(fā)病的漸進性特征，通過腹腔注射LPS也能誘導(dǎo)PD模型，但會引起炎癥反應(yīng)和肝腎功能損害[11，28，29]。經(jīng)鼻暴露LPS可導(dǎo)致嗅覺神經(jīng)元缺失，與早期PD患者嗅覺減退現(xiàn)象相吻合，表明經(jīng)鼻暴露LPS可能是制備PD動物模型的潛在途徑[30]。

本研究通過小劑量、多次滴鼻給予LPS的方式，作用于C57BL/6小鼠誘導(dǎo)PD動物模型。給藥7周后，行為學(xué)實驗顯示，LPS模型組小鼠肢體協(xié)調(diào)能力、步距、動作靈敏度等運動功能較對照組均明顯下降，LPS滴鼻7周后，病理學(xué)顯示黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯減少、TH表達明顯降低、α-突觸核蛋白的表達顯著增加、神經(jīng)遞質(zhì)含量明顯減少，成功建立了符合行為學(xué)及病理學(xué)特征的PD小鼠模型。這一研究結(jié)果與He等[13]采用LPS(0.5 mg/kg)隔天滴鼻，連續(xù)5個月造模的研究結(jié)果相似，但用時更短，實用性更強，可更加快捷地用于PD發(fā)病機制、病理學(xué)變化、神經(jīng)遞質(zhì)變化及治療方法、治療效果的研究。