miR-152靶向IRS-1對結腸癌細胞增殖、遷徙及侵襲的影響

代 瑩,包 驥,許 波,姜媛媛,邱海燕,黃 藝,詹發平

(1興義市人民醫院腫瘤科,興義 562400;2四川大學華西臨床醫學院病理科;3興義市人民醫院普通外科)

結腸癌是世界范圍內最常見的消化道惡性腫瘤,發病率居所有惡性腫瘤的第3位,病死率位居第2位[1,2]。近年來,結腸癌發生率逐年升高,已成為我國發病率最高的惡性腫瘤之一,嚴重威脅人民生命健康[3],患者5年生存率不足60%[4]。因此,探討結腸癌發生發展的分子機制,對腫瘤的靶向治療具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是內源性的長度為19-25個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA,通過抑制靶基因翻譯或降解靶基因mRNA,參與機體多種生物學過程,如細胞增殖、遷移、凋亡、分化等[5]。miR-152是miR-148/152的成員之一,參與一系列細胞活動,例如細胞增殖、入侵等,在多種惡性腫瘤中發揮抑癌作用[6,7]。胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)是胰島素受體、類胰島素生長因子Ⅰ受體的重要底物,通過將細胞外的信號傳遞到細胞內,調控細胞的代謝、生長、存活、分化和惡性轉化[8]。目前,miR-152和IRS-1對結腸癌發生發展的影響尚不明確。本研究旨在探討miR-152與IRS-1的關系及對結腸癌SW480細胞增殖、遷徙、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人結腸癌細胞株SW480、胰蛋白酶、化學發光試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司;胎牛血清、DMEM培養基、Lipofectamine 2000轉染試劑、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、IRS-1抗體、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體、MMP-9抗體、β-actin抗體購自上海恒斐生物科技有限公司;熒光定量PCR試劑盒購自北京拜爾迪生物技術有限公司;TRIzol試劑、CCK-8試劑、羊抗兔IgG抗體購自北京百奧萊博科技有限公司;Transwell小室購自上海研卉生物科技有限公司;MatrigelTM基質膠購自廣州威佳科技有限公司。熒光定量PCR儀(ABI 7500)為美國Applied Biosystems公司產品;全自動酶標儀(ELX800)為美國BIO-TEK公司產品;化學發光成像系統(ChemiDocXRS)為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 細胞培養與分組

將結腸癌細胞SW480接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基中,37 ℃、5% CO2的恒溫飽和濕度培養,細胞融合率達到約80%時,用胰蛋白酶消化、傳代培養。取對數期SW480細胞(1×105個/ml)接種于96孔培養板,每孔100 μl,用Lipofectamine 2000轉染試劑分別將nonsense siRNA載體和miR-152 siRNA載體轉入到SW480細胞中,分別命名為無義轉染組和miR-152 siRNA組,不轉入任何載體的SW480細胞為對照組。轉染24 h將各組SW480細胞正常培養,待后續實驗使用。

1.3 qRT-PCR法檢測SW480細胞中miR-152和IRS-1 mRNA表達

將對照組、無義轉染組和miR-152 siRNA組SW480細胞培養24 h,收集細胞,使用TRIzol試劑提取總RNA,逆轉錄合成cDNA,采用qRT-PCR法檢測miR-152和IRS-1 mRNA表達水平,內參基因為β-actin。反應程序:95 ℃ 15 min;95 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,循環45次;72 ℃ 10 min。Ct值為擴增產物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環數,miR-152和IRS-1 mRNA相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.4 CCK-8法檢測SW480細胞增殖

將對照組、無義轉染組和miR-152 siRNA組SW480細胞培養48 h,加入CCK-8試劑后繼續培養2 h,使用全自動酶標儀于波長為450 nm處檢測各孔吸光度值(OD)。

1.5 Transwell法檢測SW480細胞遷徙

用無血清培養液將對照組、無義轉染組和miR-152 siRNA組SW480細胞稀釋為2.5×105個/ml的細胞懸液,分別向Transwell小室上層加入200 μl,下室中均加入500 μl 10%胎牛血清的培養液,置于37 ℃、5% CO2培養24 h,用無菌棉簽擦去小室膜上未穿膜的細胞,用4%多聚甲醛固定下層遷徙細胞10 min,PBS洗滌,用0.5%結晶紫染液染色20 min,PBS洗滌。倒置顯微鏡隨機選取6個視野(×200)觀察拍照,統計遷徙細胞數并計算平均值。

1.6 Transwell法檢測SW480細胞侵襲

用無血清培養基稀釋Matrigel基質膠(1 ∶8),向每個Transwell小室中加50 μl,37 ℃ 1 h凝固。后續操作均與1.5中檢測細胞遷徙情況步驟相同,隨機選6個視野統計侵襲細胞數。

1.7 Western blot法檢測SW480細胞IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達

將對照組、無義轉染組和miR-152 siRNA組SW480細胞培養48 h,收集細胞,使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白,使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度并定量。電泳分離、轉膜、封閉后,分別加入IRS-1、PCNA、MMP-2、MMP-9、β-actin抗體(1 ∶500),4 ℃孵育過夜,TBST洗滌,加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h,免疫反應化學發光法進行顯色,Tanon 600圖像分析系統拍攝圖像并分析,目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/內參β-actin灰度值。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 SW480細胞中miR-152和IRS-1 mRNA表達水平

對照組和無義轉染組SW480細胞中miR-152、IRS-1 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和無義轉染組相比,miR-152 siRNA組SW480細胞中miR-152表達水平顯著降低(P<0.05),IRS-1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05,見圖1)。

2.2 SW480細胞增殖情況

對照組和無義轉染組SW480細胞OD值差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和無義轉染組相比,miR-152 siRNA組SW480細胞OD值顯著升高(P<0.05,見圖2)。

2.3 SW480細胞遷徙情況

對照組和無義轉染組SW480細胞遷徙細胞數差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和無義轉染組相比,miR-152 siRNA組SW480細胞遷徙細胞數顯著升高(P<0.05,見圖3)。

與對照組相比,aP<0.05;與無義轉染組相比,bP<0.05圖1 各組SW480細胞中miR-152、IRS-1 mRNA表達水平比較Figure 1 Expression levels of miR-152 and IRS-1 mRNA in SW480 cells after different treatment

與對照組相比,aP<0.05;與無義轉染組相比,bP<0.05圖2 各組SW480細胞OD值比較Figure 2 OD values in SW480 cells after different treatment

2.4 SW480細胞侵襲情況

對照組和無義轉染組SW480細胞侵襲細胞數差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和無義轉染組相比,miR-152 siRNA組SW480細胞侵襲細胞數顯著升高(P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,aP<0.05;與無義轉染組相比,bP<0.05圖3 各組SW480細胞遷徙細胞數比較Figure 3 Migrated cell numbers in SW480 cells after different treatment

與對照組相比,aP<0.05;與無義轉染組相比,bP<0.05圖4 各組SW480細胞侵襲細胞數比較Figure 4 Invasion cell numbers in SW480 cells after different treatment

2.5 SW480細胞中IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達情況

對照組和無義轉染組SW480細胞中IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和無義轉染組相比,miR-152 siRNA組SW480細胞中IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05,見圖5)。

與對照組相比,aP<0.05;與無義轉染組相比,bP<0.05圖5 SW480細胞中IRS-1、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達情況Figure 5 Expression levels of IRS-1,PCNA,MMP-2 and MMP-9 protein in SW480 cells after different treatment

3 討論

結腸癌是原發于直腸或結腸的惡性腫瘤,中、晚期極易發生侵襲、轉移,但是由于結腸癌早期容易被忽視,多數患者確診時伴有局部或遠處侵襲、轉移[9,10]。臨床研究表明,已經發生轉移的結腸癌患者通常無法治愈,目前主要依靠手術和化療改善生活質量、延長生存時間,但平均總生存時間依舊偏低[5]。相對于傳統化療藥物,分子靶向治療的特異性更強、副作用更小,但臨床上缺乏結腸癌的有效分子靶向藥物[11,12]。因此,調控結腸癌侵襲、轉移的作用機制和治療結腸癌的有效靶點的研究仍是目前結腸癌研究領域的熱門區域。

結腸癌細胞的侵襲、轉移是一個復雜的過程,涉及到多種癌基因和抑癌基因的表達異常[13]。而miRNA表達異常是其中的重要環節,已被證實參與癌癥發生發展過程,通常能作為腫瘤早期診斷標志物和腫瘤靶向治療靶點[14]。研究表明,miRNA與靶基因mRNA上的非編碼區域(R內含子區域或3′-UT)不完全或完全互補配對,通過降解靶基因或抑制靶基因的翻譯,參與調控細胞增殖、分化、凋亡、組織發育等多種生理病理過程[5]。miR-152是miR-148/152家族的一員,據報道,miR-152在多種癌癥中發揮抑癌作用。倪莎等[15]研究表明,miR-152可能通過靶向調節Mirk/Dyrk1B影響人卵巢癌干細胞球對紫杉醇的敏感性。研究[16,17]表明,miR-152通過抑制CDC25B或WNT1、ERBB3的表達,抑制人子宮內膜癌細胞和宮頸癌細胞增殖。本研究結果顯示,沉默SW480細胞中miR-152表達后,SW480細胞OD值、遷徙細胞數、侵襲細胞數顯著升高,提示miR-152在結腸癌SW480細胞中同樣發揮抑癌作用,抑制miR-152表達后可促進SW480細胞的增殖、遷徙與侵襲,但在SW480細胞中的具體調控機制尚不明確。

IRS-1是胰島素底物家族中的胰島素受體酪氨酸激酶底物,是胰島素樣生長因子Ⅰ信號轉導途徑中最重要的底物,參與激活下游轉導通路,發揮促進腫瘤細胞增殖、分化及遷移的作用[18]。李楠等[19]研究表明,IRS1可被miR-126靶向調控表達下調,抑制結腸癌增殖、侵襲及轉移。Xu等[20]研究表明,過度表達miR-148a/mir-152通過靶向IGF-IR、IRS-1并抑制其下游AKT、MAPK/ERK信號通路,顯著抑制乳腺癌細胞增殖、集落形成和腫瘤血管生成。本研究結果顯示,沉默SW480細胞中miR-152表達后,SW480細胞中IRS-1 mRNA水平顯著上升,提示結腸癌中miR-152可能靶向調控IRS-1 mRNA表達發揮作用,這與Xu等[20]在乳腺癌細胞中的研究一致,當沉默SW480中miR-152表達后,IRS-1表達上調參與SW480細胞增殖、遷徙、侵襲。

PCNA是增殖相關基因,參與SW480細胞增殖過程[21]。MMP-2、MMP-9是鋅離子依賴的蛋白水解酶家族MMP家族成員,在腫瘤細胞侵襲中發揮重要作用[22]。本研究結果顯示,沉默SW480細胞中miR-152表達后,SW480細胞中IRS-1、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均顯著升高,提示沉默SW480中miR-152表達后,上調IRS-1表達的同時,影響PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平,促進SW480細胞增殖、遷徙與侵襲。

綜上所述,miR-152可能靶向IRS-1表達,抑制結腸癌細胞增殖、遷徙及侵襲過程。但結腸癌增殖、遷徙、侵襲途徑復雜,還需進一步探究miR-152靶向IRS-1過程涉及到的細胞內信號通路,及在不同結腸癌細胞中的作用途徑,以期為治療結腸癌提供有效靶點。