前列腺癌干細胞CD147的表達及與患者細胞免疫水平的相關性

李蘇亮,劉 冰,袁小華,相 蓮,王雨琛,葉 蕓

(西安醫學院第一附屬醫院輸血科,西安 710077;*通訊作者,E-mail:yeyun236@163.com)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性泌尿系統較常見的惡性腫瘤之一,在歐美人群中的發病率高居首位,死亡率僅次于肺癌[1,2]。亞洲地區被認為是前列腺癌低發區,但隨著我國人口老齡化的發展以及飲食結構的改變,前列腺癌的發病率呈現逐年升高的趨勢[3]。目前臨床選用的前列腺特異性抗原(PSA)等標志物的敏感性和特異性較差,難以滿足臨床需要[4]。因此,選擇具有高敏感性和特異性的腫瘤標志物對于PCa的診斷和治療具有重要意義。CD147作為免疫球蛋白家族的一員,在多種腫瘤細胞表面表達[5,6]。CD147通過刺激基質金屬蛋白酶的合成,以不同的方式參與腫瘤的侵襲和轉移[7]。研究表明CD147可能與PCa的發病機制密切相關[8],但是關于前列腺癌干細胞CD147的表達情況及CD147與細胞免疫水平之間的關系仍需進一步研究。因此,本研究選擇2016-03～2019-06入院的60例前列腺癌患者作為對象,探討CD147在前列腺癌干細胞中的表達及其與患者細胞免疫水平之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2016-03～2019-06西安醫學院第一附屬醫院接受手術治療的轉移性前列腺癌患者和未轉移性前列腺癌患者各30例,患者一般資料見表1。術中收集患者的腫瘤組織,兩組人群均空腹采集靜脈血5 ml,室溫靜置30 min,3 000g離心15 min分離血清,-80 ℃凍存。本研究得到西安醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。

表1 納入患者的一般資料

Table 1 Characteristics of the included patients

轉移組未轉移組χ2P年齡0.2870.592 <70歲1012 ≥70歲2018PSA4.040.040 <10 ng/ml217 ≥10 ng/ml813Gleason評分11.380.001 <81023 ≥8207臨床分期15.4290.001 T1/T2520 T3/T42510

1.2 前列腺癌干細胞的分離培養

所有患者均行手術治療,取前列腺癌癌病灶組織,采用差速離心法完成細胞分離。具體方法如下:將其放在含有10.0%胎牛血清的DMEM培養液中浸泡5 min,PBS反復沖洗后去除脂肪等組織,利用10 ml注射器抽取含有10.0%胎牛血清的培養基,4 500 r/min離心20 min,結束后用吸管輕輕吹打細胞,加入10 ml生理鹽水進行重懸沉淀。對懸液再次離心,500 r/min離心5 min,加入10 ml生理鹽水,以1.0×106/ml密度接種在培養瓶中,于37 ℃,5% CO2培養。

1.3 CD147陽性表達細胞數的測定

根據細胞的形態、生長曲線及流式細胞結果完成腫瘤干細胞鑒定[9]。取采集的前列腺癌干細胞,4 000 r/min離心15 min,采用流式細胞儀測定兩組細胞中表達CD147的細胞數。取上述分離、制備的干細胞2×106/ml,加入24孔培養板中,將其放置在37 ℃ 5%CO2培養箱中培養,分別加入10 ml CD3-APC和CD4-FITC抗體,室溫避光孵育30 min。洗滌后去除上清液,4%多聚甲醛進行固定,放置20 min。0.1%皂素進行10 min穿膜,去除上清液后每管留穿膜液重懸細胞200 μl;向實驗管中加入10 μl Foxp3抗體,避光孵育1 h,洗滌后穿膜液重懸細胞500 μl后放入流式細胞儀上測定。

1.4 細胞因子檢測

兩組患者分別取空腹靜脈血5ml,4 500 r/min離心15 min,血清分離完畢后采用酶聯免疫吸附試驗測定白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(INF-γ)水平、白細胞介素-10(IL-10)和白細胞介素-6(IL-6),操作步驟均按照試劑盒說明書完成。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 前列腺癌干細胞鑒定

倒置顯微鏡下前列腺癌干細胞接種在10%胎牛血清的DMEM培養基中,細胞生長曲線顯示細胞第3天進入對數增長期,第9天進入平臺期。流式細胞儀測定結果表明:前列腺癌干細胞表面標志物CD133+細胞群含量達到83.2%(見圖1)。

2.2 轉移組和未轉移組CD147表達水平比較

轉移組CD147陽性表達率33.7%(10/30),未轉移組CD147陽性表達率6.7%(2/30),兩組之間差異有統計學意義(χ2=6.667,P=0.01)。

2.3 轉移組與未轉移組炎癥因子水平比較

轉移組IL-2和INF-γ水平高于未轉移組,轉移組IL-10和IL-6水平低于未轉移組(P<0.05,見表2)。

2.4 CD147的表達與細胞免疫水平相關性分析

轉移組患者CD147的表達與IL-2和INF-γ水平呈正相關,但與IL-10和IL-6呈負相關(均P<0.05,見表3)。

A.倒置顯微鏡結果 B.細胞生長曲線C.流式細胞術檢測CD133的表達圖1 前列腺癌干細胞的鑒定Figure 1 Identification of prostate cancer stem cells

表2 轉移組與未轉移組炎癥因子水平比較

Table 2 Comparison of inflammatory factor levels between metastatic and non-metastatic prostate cancer patients

分組nIL-2(ng/L)INF-γ(μg/L)IL-10(ng/L)IL-6(ng/L)轉移組 30 376.53±13.4833.48±4.7251.78±13.3773.39±8.71未轉移組30 137.13±6.7323.31±3.41142.73±14.56156.78±11.86t13.53 15.7611.3810.65P0.0010.0010.0010.001

表3 CD147的表達與細胞免疫水平相關性分析

Table 3 Correlation analysis of CD147 expression and the level of cellular immunity

統計參數CD147與IL-2CD147與INF-γCD147與IL-10CD147與IL-6轉移組未轉移組轉移組未轉移組轉移組未轉移組轉移組未轉移組r0.4810.2530.6720.189-0.516-0.207-0.768-0.154P0.0180.1650.0230.2080.0190.1270.0120.196

3 討論

2005年,Collins等[9]首次從前列腺癌組織中分離出腫瘤干細胞,其增殖和分化能力遠大于其他前列腺腫瘤細胞,并可在雄激素缺乏條件下存活。腫瘤干細胞與腫瘤發生轉移密切相關,該細胞不同于普通癌細胞,具有自我更新、無限分化潛能,是前列腺癌治療失敗的根本原因[10]。前列腺癌的發生、常伴有機體免疫系統與腫瘤細胞之間的相互作用,免疫系統通過重塑腫瘤細胞抗原性,影響機體免疫功能的正常發揮[11]。本研究從前列腺癌組織中分離獲得前列腺癌干細胞,前列腺癌干細胞表面標志物CD133+細胞群含量達到83.2%;細胞生長曲線顯示細胞第3天進入對數增長期,第9天進入平臺期;流式細胞儀測定結果進一步確定本研究分離制備的干細胞為前列腺癌干細胞,能為本研究下一步實驗的進行奠定基礎。

CD147是屬于免疫球蛋白超家族的一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，其主要功能包括參與細胞間或者細胞和基質之間的黏附作用[12]。同時,CD147表達于所有的淋巴細胞表面,參與淋巴細胞的分化,作為細胞外基質金屬蛋白酶的誘導劑發揮免疫調節作用[13,14]。研究發現CD147是腫瘤預后的指標,其可增強基質金屬蛋白酶活性進而促進癌細胞遷移、入侵和轉移,實現腫瘤細胞的自我更新并有助于腫瘤干細胞繼續生長、發展[15]。CD147介導的糖酵解代謝可能在腫瘤微環境中誘導免疫逃逸,通過免疫機制逃避機體的免疫監視,從而提高了免疫耐受作用[16]。本研究中,轉移性前列腺癌組CD147陽性表達率33.7%,未轉移組CD147陽性表達率6.7%,兩組之間差異有統計學意義(P<0.05)。

前列腺癌的發生、發展常伴有免疫水平的變化及炎癥因子的共同參與[17]。根據分泌細胞因子不同將輔助性T淋巴細胞分為Th0、Th1、Th2及Th3四種不同的類型,而在人體中主要以Th1、Th2為主[18]。Th1細胞主要分泌IL-2和INF-γ等,能介導細胞毒作用,其表達水平與機體局部免疫應答有關,能輔助相關抗體的生成,直接參與細胞免疫。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等炎癥因子,其表達水平多與體液免疫水平有關。Th1與Th2處于一個動態平衡,共同維持機體細胞免疫與體液免疫[19]。但是,前列腺癌患者由于癌細胞的持續增殖、生長,導致機體的免疫平衡被打破。本研究中,轉移組IL-2和INF-γ水平高于未轉移組(P<0.05);而轉移組IL-10和IL-6水平低于未轉移組(P<0.05)。進一步提示前列腺癌患者中伴有免疫水平失衡且與轉移的發生發展有關。本研究中進一步分析了CD147的表達水平與前列腺癌患者細胞免疫水平的關系,結果顯示轉移性前列腺癌CD147在干細胞中表達與IL-2和INF-γ水平呈正相關性,而與IL-10和IL-6水平呈負相關(P<0.05)。結果說明轉移性前列腺癌患者腫瘤干細胞CD147高表達進而促進Th1細胞活性導致機體細胞免疫與體液免疫失衡。80%-90%的前列腺癌患者晚期均有不同程度的轉移,約50%的轉移患者在確診后30-35個月內死亡。因此,前列腺癌患者的CD147及細胞免疫水平的定期監測可有助于及時判斷轉移的發生與否并采取有效的措施進行治療、干預。

綜上所述,CD147在轉移性前列腺患者的PCa干細胞中呈高表達,且與患者細胞免疫水平具有相關性。CD147表達水平及患者細胞免疫水平相關指標的檢測對前列腺癌的病情判定及治療、預后評估具有一定的臨床指導價值。