miRNA-30e-5p抑制骨肉瘤細胞增殖、轉移的機制研究

徐 澤,黃 威,馬銳祥,史國光,尚希福,朱 晨

(中國科學技術大學附屬第一醫院,安徽省立醫院骨科,合肥 230001;*通訊作者,E-mail:zhuchen19790820@sina.com)

骨肉瘤是常見的原發性惡性腫瘤,好發于長骨干骺端,0-19歲兒童和青少年發病率較高。臨床常見表現為關節腫脹、疼痛、活動受限以及肌肉萎縮等癥狀[1]。骨肉瘤的主要治療方法是手術切除、輔助化療和放射治療。在過去20年中治療效果已取得了很大的進步,非轉移性骨肉瘤患者的5年生存率已提升至65%左右[2,3]。然而不幸的是,大多數患者確診時已是晚期,預后差且病死率較高。故而,尋找新的生物標志物和治療靶點對骨肉瘤的治療具有重大意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來發現的一種內源性的小分子RNA,在腫瘤、代謝、內分泌系統、胚胎干細胞等方面具有多種功能[4-6]。雖然miRNA不能編碼蛋白質,但其可通過與下游靶基因3’-UTR區的堿基互補配對來降解mRNA或直接阻斷蛋白質翻譯[7,8]。miRNA-30e-5p作為miRNA-30家族中的一員,已經證實在前列腺癌、頭頸部腫瘤和膀胱癌組織中表達下調,發揮腫瘤抑制因子的作用[9-11]。但miRNA-30e-5p在骨肉瘤中的作用仍不明確。因此,本研究將分析miRNA-30e-5p對骨肉瘤細胞增殖、轉移的影響并探究其分子機制,以期為骨肉瘤的臨床治療提供新的方法和思路。

1 材料和方法

1.1 臨床標本

選擇2018-09～2019-09由中國科學技術大學附屬第一醫院骨科手術室收集的30對骨肉瘤組織和癌旁正常組織,所有的組織快速冷凍于液氮,其后于-80 ℃長期保存用于后續實驗。所有入選患者均無放療和化療史。

1.2 細胞株和主要試劑

人骨肉瘤細胞株U2OS、Saos-2、MG-63和人成骨細胞hFOB購于ATCC細胞庫(美國)。CCK-8試劑盒、Trizol試劑由合肥颯英斯生物試劑公司提供。Transwell小室由Corning公司(美國)提供。Lipofectamine 2000轉染試劑盒由Abcam生物公司(英國)提供。RPMI-1640和胰酶溶液由Hyclone公司(美國)提供;opti-MEM和胎牛血清由Gibco生物公司(美國)提供。miRNA-30e-5p mimics(模擬物)、miRNA-30e-5p inhibitor(抑制物)、mimics NC(模擬物陰性對照)、inhibitor NC(抑制物陰性對照)和實驗中所有引物均由安徽(滁州)通用生物公司提供。USP22、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH抗體由CST生物公司(美國)提供。

1.3 細胞培養

將液氮中凍存的的骨肉瘤和成骨細胞取出，迅速在37 ℃恒溫水浴鍋搖晃，使其快速融化，隨后轉移至15 ml無菌離心管中并加入5 ml培養基重懸、離心。用含有10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當單層細胞生長至70%-90%，胰酶消化細胞，傳代繼續培養備用。

1.4 細胞轉染

用PBS洗滌對數生長期的細胞,胰酶消化后重懸、計數。將6×105個細胞接種于6孔板,繼續培養24 h進行轉染。分別構建miRNA-30e-5p過表達細胞模型,分為mimics NC組(模擬物陰性對照)和miRNA-30e-5p mimics組;構建miRNA-30e-5p敲低細胞模型,分為inhibitor NC組(抑制劑陰性對照)和miRNA-30e-5p inhibitor組。分別用250 μl opti-MEM稀釋mimics NC、miRNA-30e-5p mimics、inhibitor NC和miRNA-30e-5p inhibitor,同時使用250 μl opti-MEM稀釋Lipofectamine 2000,將兩組輕柔混勻,室溫靜止20 min。加500 μl轉染復合物至6孔板,繼續培養4 h,更換新鮮培養基,繼續培養48 h,用于miRNA-30e-5p轉染效率的檢測。

1.5 qRT-PCR檢測miRNA表達情況

Trizol法抽提組織和細胞中RNA,使用天根生物反轉錄試劑盒對miRNA進行加尾和反轉錄。用熒光定量試劑盒檢測樣品中miRNA-30e-5p表達量,以U6作為內參。miRNA-30e-5p上游引物:5′-GGCGTGTAAACATCCTTGACTG-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物:5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應程序為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖

將轉染后的U2OS細胞消化計數、調整細胞密度為1×105/ml的細胞懸液,取100 μl接種至96孔板。在細胞培養箱中繼續培養24,48,72 h,每天同一時間每孔中加入10 μl CCK-8溶液,培養箱中繼續培養2 h,酶標儀檢測450 nm時吸光度OD值。

1.7 克隆形成實驗

將轉染后的U2OS細胞消化計數、調整細胞密度為2×104/ml的細胞懸液,取100 μl接種至6孔板,并補齊培養基至2 ml。在細胞培養箱中繼續培養10 d至肉眼可見克隆形成,終止培養,PBS洗滌后中性甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色1 h,流水洗凈烘干,顯微鏡下觀察計數。

1.8 Transwell檢測細胞轉移能力

轉染后生長狀態良好的骨肉瘤U2OS細胞消化計數,用無血清培養基重懸成單細胞調整細胞密度,接種4×104個細胞于Transwell上室,下室加入10%血清的培養基。培養箱繼續培養24 h,0.1%結晶紫染色后用棉簽輕柔擦去上室內的基質膠和細胞,顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數,取平均值進行分析。

1.9 Targetscan網站進行靶基因預測

采用Targetscan網站在線進行miRNA-30e-5p靶基因預測。

1.10 Western blot檢測蛋白表達

將轉染后的U2OS細胞冰上裂解，提取總蛋白，進行變性處理。蛋白質經電泳、轉膜至PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；USP22、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH(稀釋比均為1 ∶1 000，稀釋液為5%脫脂牛奶)一抗4 ℃冰箱過夜，PBST洗膜3次，每次5 min；兔二抗(稀釋比均為1 ∶5 000，稀釋液為5%脫脂牛奶)室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；采用ECL發光試劑進行曝光。

1.11 統計學分析

2 結果

2.1 miRNA-30e-5p在骨肉瘤組織和細胞中低表達

首先檢測骨肉瘤臨床標本中miRNA-30e-5p的表達水平,qRT-PCR結果表明與癌旁正常組織相比,腫瘤組織中miRNA-30e-5p水平顯著降低(P<0.05,見圖1)。隨后,分析了人成骨hFOB細胞和骨肉瘤U2OS、Saos-2、MG-63細胞中miRNA-30e-5p的表達情況,qRT-PCR結果表明其在骨肉瘤細胞中也顯著低表達(P<0.05,見圖1)。

圖1 miRNA-30e-5p在骨肉瘤組織和細胞中的表達情況Figure 1 Expression of miRNA-30e-5p in osteosarcoma tissues and cells

2.2 過表達miRNA-30e-5p抑制U2OS細胞的增殖、轉移

U2OS細胞轉染miRNA-30e-5p mimics后,與對照組相比,過表達組miRNA-30e-5p顯著升高(P<0.05,見圖2A)?？寺⌒纬珊虲CK-8實驗表明,過表達組細胞存活率和克隆數量顯著降低(P<0.05,見圖2B、C)。Transwell實驗表明,相比于對照組,過表達組細胞轉移數目明顯減少(P<0.05,見圖2D)。

2.3 下調miRNA-30e-5p表達促進U2OS細胞的增殖、轉移

U2OS細胞轉染miRNA-30e-5p inhibitor后,相比與對照組,抑制組miRNA-30e-5p顯著降低(P<0.05,見圖3A)?？寺⌒纬珊虲CK-8實驗表明,抑制組細胞存活率和克隆數量顯著升高(P<0.05,見圖3B、C)。Transwell實驗表明,抑制組細胞轉移數目明顯增加(P<0.05,見圖3D)。

2.4 miRNA-30e-5p能抑制USP22表達

使用在線預測網站對miRNA-30e-5p的靶基因進行分析,結果顯示miRNA-30e-5p可能與USP22存在靶向關系(見圖4)。通過Western blot實驗發現,過表達miRNA-30e-5p能抑制USP22的表達(見圖4);抑制miRNA-30e-5p能增加USP22的蛋白水平(見圖4)。證實miRNA-30e-5p能夠靶向抑制USP22的表達。

圖2 過表達miRNA-30e-5p對骨肉瘤U2OS細胞增殖、轉移的影響Figure 2 Effect of miRNA-30e-5p overexpression on the proliferation and metastasis of osteosarcoma U2OS cells

圖3 抑制miRNA-30e-5p表達對骨肉瘤U2OS細胞增殖、轉移的影響Figure 3 Effect of inhibition of miRNA-30e-5p expression on the proliferation and metastasis of osteosarcoma U20S cells

圖4 miRNA-30e-5p對USP22的調控作用Figure 4 Regulation of miRNA-30e-5p on USP22

2.5 miRNA-30e-5p能抑制U2OS細胞EMT過程

Western blot實驗證實,過表達miRNA-30e-5p后E-cadherin蛋白水平上調、N-cadherin蛋白水平下調(見圖5)。相反,抑制miRNA-30e-5p表達后E-cadherin蛋白水平下調、N-cadherin蛋白水平上調(見圖5)。證實miRNA-30e-5p能夠抑制骨肉瘤U2OS細胞的EMT過程。

圖5 miRNA-30e-5p對EMT相關蛋白表達的影響Figure 5 Effect of miRNA-30e-5p on E-cadherin and N-cadherin protein expression

3 討論

miRNA在腫瘤發展過程中對調節細胞功能和生物學過程具有顯著作用。研究發現,miRNA-21、miRNA-320a、miRNA-210-5p等異常表達會影響骨肉瘤細胞的增殖、轉移及不良預后[12-14],說明miRNA與骨肉瘤的惡性進展密切相關。已有研究表明miRNA-30e-5p在頭頸部鱗狀細胞癌[11]、前列腺癌[15]、神經膠質瘤[15]等多種腫瘤中低表達,并能抑制腫瘤的發生發展,但目前尚無有關miRNA-30e-5p在骨肉瘤中的潛在功能和機制的研究。本研究首次證實,miRNA-30e-5p在骨肉瘤組織和細胞中低表達,初步表明其在骨肉瘤的惡性發展中可能發揮抑癌功能。細胞生物學實驗表明miRNA-30e-5p能夠抑制骨肉瘤U2OS細胞的增殖和轉移。

miRNA是一種長度約為22個核苷酸的內源性非編碼RNA,在機體生物學過程中發揮重要作用。miRNA通過堿基互補的方式與靶基因mRNA的3′-UTR結合,抑制mRNA的翻譯,從而負調控靶基因表達[16]。有研究報道,前列腺癌中miRNA-30e-5p可抑制CTHRC1表達,進而降低細胞的增殖、轉移能力[17]。本研究通過生物信息學預測表明miRNA-30e-5p能夠與USP22的mRNA結合,Western blot實驗表明骨肉瘤細胞中miRNA-30e-5p確能下調USP22的蛋白表達。初步證實miRNA-30e-5p可調控USP22表達進而抑制骨肉瘤的惡性進展。

USP22是一種新的去泛素化酶,屬于泛素水解酶蛋白質家族的一員,能夠通過去泛素化組蛋白殘基調控基因轉錄。USP22最初是由Glinsky等[18]在基因微陣列的研究中發現的,它被認為在許多生理和病理過程中具有重要作用,如細胞周期、細胞增殖和腫瘤侵襲。已經發現USP22在不同類型的癌癥中異常表達,與各種癌癥患者的腫瘤復發、遠處轉移、不良預后和治療失敗有關[19]。已有研究表明,USP22可通過調控COX-2和p53結合蛋白MDMX來促進非小細胞肺癌的發生發展[20]。此外,已有研究證實USP22在骨肉瘤中過表達,并且能夠促進骨肉瘤細胞的增殖、轉移[21]。本研究表明miRNA-30e-5p能夠靶向USP22,并負調控其表達。進一步證實miRNA-30e-5p在抑制骨肉瘤增殖和轉移中具有重要作用。

EMT是指上皮細胞失去細胞極性,降解細胞間連接,增加細胞運動性并獲得侵襲特性,成為間充質細胞的生物過程。EMT過程的異常激活被認為是促進腫瘤轉移的關鍵,因為它增加了癌細胞的活力、侵襲性和遷移性[22]。研究發現EMT過程在骨肉瘤發生發展中具有重要作用,靶向調控EMT過程的相關轉錄因子有望成為骨肉瘤臨床治療的新策略[23]。本研究證實,miRNA-30e-5p能上調E-cadherin蛋白表達,下調N-cadherin蛋白表達,進而抑制EMT過程。此外,已有研究證實USP22在骨肉瘤中可以激活EMT過程[21],初步說明miRNA-30e-5p可通過USP22調控EMT過程。誠然,USP22在骨肉瘤中調控EMT過程的具體分子機制仍需在未來深入研究。

本研究首次證實miRNA-30e-5p可下調USP22表達抑制EMT過程,從而影響骨肉瘤的惡性進展,以期為骨肉瘤的臨床治療提供新的策略。