新型佐劑α-甘露聚糖肽對(duì)E75多肽腫瘤疫苗在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)免疫效果的影響

王 威,許 薇,王亞文,李義平,王 冰

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,西安 710061;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院藥物化學(xué)系;3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系;*通訊作者,E-mail:Wangbing@mail.xjtu.edu.cn)

α-甘露聚糖肽又名多抗甲素(polyactin A,PA)是從正常人咽喉部分離的甲型溶血性鏈球菌33號(hào)菌株的深層培養(yǎng)液中經(jīng)乙醇提取得到的一種糖肽類物質(zhì)[1],是西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院自主研發(fā)的國(guó)內(nèi)首創(chuàng)的生物反應(yīng)修飾物,具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。PA是由糖鏈結(jié)構(gòu)一致、分子量和氨基酸含量不同的幾種均一糖肽構(gòu)成的混合物,具有特殊的生物活性,對(duì)各類免疫細(xì)胞均存在正向調(diào)節(jié)的作用,具有成為免疫佐劑的潛能[1-3]。PA作為佐劑應(yīng)用于基于體液免疫的EV71疫苗以及甲型流感疫苗取得了良好的效果[3-5]。然而,PA是否對(duì)基于細(xì)胞免疫的多肽類腫瘤疫苗具有佐劑作用還需確認(rèn)。E75 P369-377(KIFGSLAFL)是HER2/neu蛋白胞外區(qū)的的一段具有免疫原性的多肽,也是HLA-A2限制性表位,可以被細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)識(shí)別[6,7]。經(jīng)證實(shí),E75肽疫苗對(duì)預(yù)防HER2/neu過表達(dá)的乳腺癌治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是安全、有效的。本研究以目前效果明確的且基于細(xì)胞免疫的E75多肽配伍不同濃度的PA,主動(dòng)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠,探討PA作為基于細(xì)胞免疫的多肽類腫瘤疫苗佐劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6-8周齡雌性C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)1Enge/J小鼠(HLA-A2+轉(zhuǎn)基因小鼠),體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。

1.2 主要試劑與儀器

α-甘露聚糖肽(成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司);E75多肽(成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司);CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);IFN-γ ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司);兔抗鼠PerCP標(biāo)記的CD3,PE標(biāo)記的CD4,FITC標(biāo)記的CD8流式試劑(美國(guó)BD Biosciences公司);RPMI-1640、胎牛血清(美國(guó)HyClone公司);植物血凝素(PHA,美國(guó)Sigma公司);小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?。CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);流式細(xì)胞儀FACscanto Ⅱ(美國(guó)BD Biosciences公司)。

1.3 動(dòng)物分組及免疫接種

C57BL/6-Tg(HLA-A2.1)1Enge/J雌性小鼠共51只,隨機(jī)分為6組。4組佐劑疫苗組與單獨(dú)E75疫苗免疫組,每組9只小鼠,其中3只小鼠僅免疫一次,用于急性毒性觀察;同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,含6只小鼠。佐劑疫苗組抗原E75定量為50 μg/0.1 ml,PA佐劑劑量采用對(duì)數(shù)等距設(shè)計(jì),劑量設(shè)置包括30 μg/0.1 ml、100 μg/0.1 ml,300 μg/0.1 ml,1 000 μg/0.1 ml,標(biāo)記為E75+30 μg PA組,E75+100 μg PA組,E75+300 μg PA組,E75+1 000 μg PA組;單獨(dú)E75疫苗免疫組,E75定量為50 μg/0.1 ml,標(biāo)記為E75組;空白對(duì)照組僅注射生理鹽水。E75和PA采用生理鹽水按上述濃度溶解,臨用時(shí)按比例混合,總體積為0.2 ml。所有組小鼠進(jìn)行頸背部與后腿部皮下兩點(diǎn)接種,分別于第0,7,14天免疫,于第28天進(jìn)行樣本采集。

1.4 甘露聚糖肽佐劑多肽E75的局部刺激性與急性毒性觀察

對(duì)所有小鼠的外觀體征、行為活動(dòng)、局部刺激性進(jìn)行觀察。局部刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。局部刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:無刺激性(0-0.49分),輕度刺激性(0.5-2.99分),中度刺激性(3.0-5.99分),強(qiáng)刺激性(6.0-8.0分)。E75+30 μg PA組,E75+100 μg PA組,E75+300 μg PA組,E75+1 000μg PA組及E75組各3只小鼠在首次給藥后第2天行斷椎處死,取心、肺、脾、腎和肝臟進(jìn)行病理切片,觀察各臟器是否存在急性毒性反應(yīng)的病理變化。

表1 局部刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Grading criteria for local stimulus response

1.5 體質(zhì)量監(jiān)測(cè)

分別在免疫第1天、第7天、第14天和第28天稱量體質(zhì)量。每次在同樣時(shí)間段稱取每只小鼠體質(zhì)量,記錄并繪制每組小鼠平均體質(zhì)量的變化趨勢(shì)。

1.6 E75肽特異性淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

免疫過程結(jié)束后,小鼠行斷椎處死,立即取出脾臟。脾臟經(jīng)碾磨后,懸液于200目鋼網(wǎng)濾過。將濾液疊加于2 ml淋巴細(xì)胞分離液上,采用2 000 r/min,離心15 min。取中間細(xì)胞層,用2 ml PBS洗滌2次,棄上清。加入1 ml含10%胎牛血清的RPMI-1640制成脾細(xì)胞懸液,取10 μl進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,在顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),并調(diào)整脾細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)/ml備用。實(shí)驗(yàn)組為E75+30 μg PA組,E75+100 μg PA組,E75+300 μg PA組,E75+1 000 μg PA組及E75組小鼠脾細(xì)胞;空白對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞分別用于設(shè)置細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入50 μg/ml E75再刺激;陽性對(duì)照組加入10 μg/ml PHA刺激;陰性對(duì)照組僅含脾細(xì)胞和培養(yǎng)液,100 μl/孔加入96孔板,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)3 d后,每孔加CCK-8試劑10 μl,繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度,按下式計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI):SI=實(shí)驗(yàn)孔OD平均值/陰性對(duì)照孔OD平均值。

1.7 IFN-γ細(xì)胞因子檢測(cè)

脾細(xì)胞處理如1.6所示。取濃度為5×104個(gè)/ml的脾細(xì)胞,E75+30 μg PA組,E75+100 μg PA組,E75+300 μg PA組,E75+1 000 μg PA組及E75組小鼠脾細(xì)胞加入50 μg/ml E75刺激;空白對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞僅加入培養(yǎng)液,100 μl/孔加入96孔板,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)3 d后,將培養(yǎng)板進(jìn)行1 000 r/min,共離心10 min。離心后,分別取各組上清液按IFN-γ細(xì)胞因子ELISA試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。樣本于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度,計(jì)算各組特異性細(xì)胞因子IFN-γ的水平。

1.8 淋巴細(xì)胞亞群分析

小鼠行斷椎處死前,于內(nèi)眥靜脈取血,采集約200 μl全血于EDTA抗凝管中,充分混勻使其抗凝備用。每只小鼠取EDTA抗凝全血50 μl,加入PerCP標(biāo)記的CD3,PE標(biāo)記的CD4,FITC標(biāo)記的CD8熒光抗體各20 μl。標(biāo)本室溫避光孵育20 min后,加入500 μl PBS后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果組間比較采用單因素方差分析,各組間樣本均數(shù)的兩兩比較采用q檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA佐劑多肽E75疫苗的局部刺激性和急性毒性觀察

對(duì)小鼠的外觀體征進(jìn)行觀察，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)各組小鼠毛色光滑，行為活動(dòng)正常。通過對(duì)PA佐劑多肽E75疫苗注射部位局部觀察，按照“局部刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)”記錄注射部位局部的狀態(tài)，E75+30 μg PA組、E75+100 μg PA組、E75+300 μg PA組、E75+1 000 μg PA組及E75組及空白對(duì)照組的評(píng)分均為0分，表明PA佐劑多肽E75疫苗對(duì)注射部位局部沒有刺激性。E75+30 μg PA組、E75+100 μg PA組、E75+300 μg PA組、E75+1 000 μg PA組及E75組小鼠首次給藥后，取小鼠心、肺、脾、腎和肝臟進(jìn)行病理切片，均未見病理性改變。結(jié)果表明，PA佐劑多肽E75疫苗對(duì)小鼠無急性毒性。

2.2 體質(zhì)量監(jiān)測(cè)結(jié)果

給藥后,各組小鼠體質(zhì)量變化見圖1。PA佐劑多肽E75疫苗組、E75單獨(dú)免疫組與空白對(duì)照組小鼠體質(zhì)量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,體質(zhì)量增長(zhǎng)率接近,并且在各時(shí)間點(diǎn),PA佐劑多肽E75疫苗各組小鼠平均體質(zhì)量及單獨(dú)E75單獨(dú)免疫組與空白對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05),表明PA佐劑多肽E75疫苗對(duì)小鼠體質(zhì)量無影響。

2.3 各組E75特異性脾淋巴細(xì)胞增殖率的比較

免疫后的小鼠分別用E75多肽、PHA再刺激,使其脾淋巴細(xì)胞體外增殖,結(jié)果見圖2。與陰性對(duì)照組相比,陽性對(duì)照組刺激指數(shù)明顯升高(P<0.05),E75組小鼠脾淋巴細(xì)胞未出現(xiàn)明顯增殖效應(yīng)(P>0.05)。與E75組相比,E75+30 μg PA組和E75+100 μg PA組脾淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)明顯增強(qiáng)(P<0.05),且E75+100 μg PA組增殖效應(yīng)最強(qiáng)。E75+300 μg PA組與E75+PA 1 000 μg組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)降低,且與E75組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。由此表明,E75多肽刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生免疫效應(yīng)需要佐劑輔助,而合適濃度的PA作為免疫佐劑可以在體內(nèi)明顯輔助增強(qiáng)E75的免疫效應(yīng)。

圖1 PA各次免疫后各組小鼠體質(zhì)量變化Figure 1 The weight variation of mice in different groups after each immunization

與陰性對(duì)照組相比,#P<0.05;與E75組相比,*P<0.05圖2 免疫計(jì)劃完成后各組小鼠E75特異性脾淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)Figure 2 E75-specific splenocytes proliferative responses of mice in different groups after the last immunization

2.4 各組特異性細(xì)胞因子IFN-γ的比較

第3次免疫后,取各組小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)E75再刺激,產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞會(huì)針對(duì)特異性抗原(E75)產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ,結(jié)果見圖3。通過利用ELISA對(duì)不同處理組細(xì)胞炎癥因子IFN-γ的分泌水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,E75多肽單獨(dú)免疫組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ含量無明顯變化(P>0.05)。然而,與E75組相比,E75+30 μg PA組和E75+100 μg PA組IFN-γ分泌明顯增加(P<0.05),且E75+100 μg PA組IFN-γ的分泌水平最高;E75+300 μg PA組與E75+1 000 μg PA組脾淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌減低,且低于E75組(P<0.05)。此結(jié)果進(jìn)一步說明在體內(nèi)PA可作為免疫佐劑輔助增強(qiáng)E75的免疫效應(yīng)。

與E75組相比,*P<0.05圖3 免疫計(jì)劃完成后各組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ分泌水平Figure 3 IFN-γ Levels of mice splenocytes in different groups after the last immunization

2.5 各組淋巴細(xì)胞亞群分析

通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)免疫后各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果見圖4。與陰性對(duì)照組相比,E75組的小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群比例無顯著差異(P>0.05)。PA協(xié)同E75多肽的佐劑疫苗組中,E75+30 μg PA組、E75+100 μg PA組與E75組相比CD4+T細(xì)胞的比例明顯增加(P<0.05),且在E75+100 μg PA組達(dá)到峰值;E75+300 μg PA組與E75+1 000 μg PA組CD4+T細(xì)胞比例降低,但仍高于E75組(P<0.05)。佐劑疫苗組的CD8+T細(xì)胞比例與E75組相比明顯增高(P<0.05),E75+30 μg PA組與E75+100 μg PA組的CD8+T細(xì)胞比例均達(dá)到峰值,且兩組間無顯著差異(P>0.05)。因此,PA作為佐劑能夠一定程度同時(shí)刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫。

與E75組相比,*P<0.05圖4 免疫計(jì)劃完成后各組小鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群分析Figure 4 Analysis of T lymphocyte subsets in peripheral blood of mice in different groups after the last immunization

3 討論

腫瘤疫苗免疫是利用腫瘤抗原或腫瘤相關(guān)抗原、免疫細(xì)胞或免疫分子激活免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的一種治療方法,已成為抗腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)。基于合成多肽的腫瘤疫苗,因?yàn)榫哂懈叩陌踩浴⒛苷T導(dǎo)高特異性免疫應(yīng)答、不引起自身免疫反應(yīng)或免疫抑制的優(yōu)點(diǎn),受到愈來愈多的關(guān)注[8]。腫瘤抗原多肽能夠結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)表面的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)分子,形成肽-MHC-T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)復(fù)合物,引起相應(yīng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫反應(yīng),從而靶向殺傷腫瘤細(xì)胞[9]。但是,腫瘤多肽疫苗通常表位小,免疫原性弱,難以引起高強(qiáng)度的免疫應(yīng)答[8,9],有必要尋找高效安全的佐劑來增強(qiáng)此類腫瘤多肽疫苗的免疫原性,提高患者機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。E75多肽疫苗是由來源于HER2/neu蛋白的合成肽E75及細(xì)胞因子佐劑粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)組成的腫瘤多肽疫苗,對(duì)預(yù)防HER2/neu過表達(dá)的乳腺癌治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是安全、有效的[6,7]。該疫苗能刺激患者自身的免疫系統(tǒng),產(chǎn)生E75特異性的CD8+CTL,并對(duì)過表達(dá)HER2/neu蛋白的乳腺腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向殺傷。由于E75是僅含9個(gè)氨基酸的小分子多肽,雖然不易誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng),但其免疫原性弱,需加入佐劑增強(qiáng)其免疫原性。本研究中,E75多肽單獨(dú)免疫的小鼠與陰性對(duì)照組相比,脾淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原再刺激后,其淋巴細(xì)胞增殖率、IFN-γ分泌水平和淋巴細(xì)胞亞群比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但加入特定濃度的PA佐劑的實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)均有提高。本研究結(jié)果再一次證實(shí),免疫原性弱的小分子腫瘤多肽疫苗需要加入佐劑提高機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。本課題選用的E75多肽,其作用原理明確,臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效,可以除外由抗原無效導(dǎo)致的不確定因素,明確PA的佐劑效應(yīng)。因此,采用E75輔助研究PA作為細(xì)胞免疫新型佐劑的可行性是合理的。

在我國(guó),PA作為一種免疫增強(qiáng)劑已有30余年的臨床應(yīng)用史,可以廣泛作用于各類免疫組織與免疫細(xì)胞,增強(qiáng)患者的抵抗力以及對(duì)抗原的應(yīng)答效應(yīng),其調(diào)節(jié)免疫的功能已得到證實(shí),并在腫瘤患者的輔助性治療中取得了良好的效果[10,11]。PA在增強(qiáng)腫瘤患者免疫反應(yīng)性方面存在明顯的優(yōu)勢(shì),有作為佐劑應(yīng)用于腫瘤多肽疫苗研發(fā)的可能性。本研究中,以PA為佐劑的E75多肽疫苗,采用HLA-A2+轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)遞呈E75多肽,刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng),被免疫小鼠無局部刺激性和急性毒性,其應(yīng)用是安全的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,特定濃度范圍內(nèi)的PA作為佐劑能夠輔助多肽E75在小鼠(HLA.A2轉(zhuǎn)基因)體內(nèi)產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答。免疫完成后,CD8+的CTL作為抗腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞,其比例在佐劑PA濃度為30 μg/0.1 ml和100 μg/0.1 ml時(shí)顯著升高;并且再接受E75抗原刺激后,其分泌的IFN-γ水平也相應(yīng)增高,在佐劑PA濃度為100 μg/0.1 ml時(shí)達(dá)到峰值。CD4+T細(xì)胞比例也在佐劑濃度為100 μg/0.1 ml時(shí)達(dá)到峰值。前期研究表明,體內(nèi)的腫瘤抗原表位特異性的免疫應(yīng)答,需要通過抗原呈遞細(xì)胞遞呈腫瘤抗原和嚴(yán)格的CD4+T細(xì)胞交叉激活,活化的CD4+輔助性T細(xì)胞是維持CTL應(yīng)答的必要條件[9,12]。因此,有效的以細(xì)胞免疫為基礎(chǔ)的腫瘤多肽疫苗需同時(shí)刺激CD4+T、CD8+T細(xì)胞的活化,本研究中小鼠的免疫應(yīng)答強(qiáng)度對(duì)PA佐劑存在劑量依賴,在佐劑PA濃度為100 μg/0.1 ml所顯示的免疫效應(yīng)達(dá)到峰值,進(jìn)一步證實(shí)了PA的佐劑作用。

本研究初期設(shè)計(jì),欲通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)整體觀察PA佐劑疫苗的免疫效應(yīng),檢驗(yàn)PA作為基于細(xì)胞免疫的多肽腫瘤疫苗佐劑的假說是否成立,基于對(duì)實(shí)驗(yàn)有效性與經(jīng)濟(jì)性的考慮,根據(jù)量效實(shí)驗(yàn)等比設(shè)計(jì)的原則,設(shè)置了多個(gè)跨度較大的佐劑濃度梯度。其中,篩選出了PA佐劑的最佳劑量,在濃度為100 μg/0.1 ml時(shí)能夠同時(shí)刺激CTL與輔助性T淋巴細(xì)胞增殖,達(dá)到最佳的免疫狀態(tài)。然而,當(dāng)PA濃度為300 μg/0.1 ml和1 000 μg/0.1 ml時(shí),雖然CD8+T細(xì)胞亞群比例升高,但其針對(duì)特異性抗原(E75)產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ與單獨(dú)疫苗組相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析原因,可能為高濃度的PA佐劑抑制了CD8+T細(xì)胞的活性,但高濃度的PA是否會(huì)抑制CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用還需進(jìn)一步確認(rèn)。

綜上所述,本研究關(guān)于PA可作為基于細(xì)胞免疫的多肽類腫瘤疫苗的佐劑的假說是成立的。進(jìn)一步選擇人體細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)是可行的,但需篩選HLA-A2基因顯性表達(dá)的個(gè)體,細(xì)化PA的濃度梯度,監(jiān)測(cè)多個(gè)免疫細(xì)胞如CD4+、CD8+T細(xì)胞以及抗原遞呈細(xì)胞樹突細(xì)胞等指標(biāo)。α-甘露聚糖肽作為有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的藥物,在我國(guó)已廣泛應(yīng)用于臨床的多個(gè)領(lǐng)域,如果能把PA作為佐劑應(yīng)用于基于細(xì)胞免疫的腫瘤多肽疫苗,擴(kuò)展PA的應(yīng)用范圍,將為患者提供更為經(jīng)濟(jì)安全的用藥選擇。