基于GEO數據庫分析RACK1在糖尿病腎小管病中的表達

馮 婕,孔冉冉,解立怡,余曉洋,劉 超

(1西安交通大學第一附屬醫院腎內科,西安 710061;2西安交通大學醫學院第二附屬醫院胸外科;*通訊作者,E-mail:619386343@qq.com)

糖尿病腎病是糖尿病嚴重的并發癥之一,是導致終末期腎衰竭的首要原因,但其發病機制目前仍不清楚。近年來許多新的證據提示糖尿病腎小管病是糖尿病腎病的啟動者,參與糖尿病腎病的發生發展[1,2]。RACK1(GNB2L1)是WD40重復蛋白家族中一員,被報道參與數種疾病的進展,其在糖尿病腎小管病中的作用卻少有人研究。本文擬以GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫為基礎,探討活化的蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase 1,RACK1)在糖尿病腎小管病中的表達及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 基于GEO數據庫分析糖尿病腎病腎小管中RACK1的表達水平

在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫中搜索糖尿病腎病,得到數據系列(GSE30528),該數據來自于人類的糖尿病腎病和正常的腎臟組織(手術切除腎臟后,取正常腎組織),利用纖維微切割技術獲取腎小管,基于Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array,得到基因表達數據。在此數據系列中,分析RACK1在糖尿病腎小管及正常對照組的腎小管中的表達情況。

1.2 KEGG中搜索RACK1參與的信號通路

從KEGG(http://www.genome.jp/kegg)中尋找RACK1參與的可能通路,以及與糖尿病腎小管病的可能關系。

1.3 細胞培養、處理和靶基因的測定

HK-2購自于美國American Type Cell Collection(ATCC,Manassas,VA)。HK-2細胞被置于加有5%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的低糖DMEM培養基中,其中糖濃度為5.5 mmol/L,放置在含有5% CO2的培養箱中培養,將其分為對照組、甘露醇組及高糖組。HK-2細胞被接種于6孔板中,24 h后約70%融合,用無血清的培養基培養24 h,無刺激HK-2細胞作為對照組,甘露醇組加入甘露醇30 mmol/L,高糖組加入D-glucose 30 mmol/L,共刺激48 h。

Trizol提取HK-2細胞總的RNA。SuperScript Ⅱ反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。再利用ABI-Prism 7500行實時定量PCR檢測。人的RACK1下游通路相關基因引物見表1。循環條件如下:預變性95 ℃ 15 min,59 ℃ 30 min,35個循環,延伸溫度72 ℃ 10 min。β-actin為內參,2-ΔΔCt方法計算相關基因的表達。

表1 qRT-PCR的引物序列

Table 1 The primer sequences of qRT-PCR

基因上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′) RACK1TTC TCC TCT GAC AAC CGG CAGCC ATC CTT GCC TCC AGA ASTAT1CAC AAG GTG GCA GGA TGT CTTCC CCG ACT GAG CCT GAT TASTAT3CTG CCC CAT ACC TGA AGA CCTCC TCA CAT GGG GGA GGT AGβ-actinGGC AAA TTC AAC GGC ACA GTCGCT GAC AAT CTT GAG TGA GTT

1.4 糖尿病腎病動物模型構建、相關指標測定和組織學變化

1.4.1 實驗動物及藥品 SPF級雄性FVB/N小鼠12只,8周齡,25-30 g購自上海斯萊克實驗動物有限公司,飼養于西安交通大學醫學院動物中心。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),購自于美國Sigma公司。

1.4.2 糖尿病動物模型的建立 12只雄性FVB/N隨機分為2組:糖尿病腎病組和對照組,每組6只,稱重,測基礎血糖。糖尿病腎病組小鼠禁食4-6 h后,給予0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)+STZ(50 mg/kg),腹腔注射,連續5 d;對照組給予同等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。2周后取尾靜脈血測血糖,血糖>16.67 mmol/L,糖尿病造模成功。

1.4.3 標本收集 每2周測體質量、血糖,留取尿液,ELSIA法測尿白蛋白/肌酐比(ACR)。12周后將老鼠放入代謝籠,收集24 h尿液測24 h尿蛋白定量。而后處死小鼠,一側腎臟-80 ℃凍存備用,切取部分組織提取RNA,行實時定量PCR;一側腎臟4%多聚甲醛固定,其中一半石蠟包埋,連續切片,行PAS染色,一半OCT包埋,-80 ℃保存,行免疫熒光染色。兔抗phospho-STAT1(p-STAT1)和兔抗phospho-STAT3(p-STAT3)購買于Cell Signaling公司;羊抗兔熒光二抗Alexa FluorTM488購買于Invitrogen公司;DAPI購買于Invitrogen公司。

1.4.4 腎組織RNA的提取及測定 Trizol提取腎組織塊中的總RNA SuperScript Ⅱ反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。再利用ABI-Prism 7500行實時定量PCR檢測。鼠的相關基因引物見表2。循環條件如下:預變性95 ℃ 15 min,59 ℃ 30 min,35個循環,延伸72 ℃ 10 min。GAPDH為內參,2-ΔΔCt方法計算相關基因的表達。

表2 qRT-PCR的引物序列

Table 2 The primer sequences of qRT-PCR

基因上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′) RACK1GTC TGC AAG TAC ACG GTC CAAAC AGA GTC TGG CCA TCA GCSTAT1GAT CGC TTG CCC AAC TCT TGCGA GAC ATC ATA GGC AGC GTSTAT3CCC CGT ACC TGA AGA CCA AGTCC TCA CAT GGG GGA GGT AGGAPDHGCC ATC AAC GAC CCC TTC ATATG ATG ACC CGT TTG GCT CC

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 基于GEO數據庫糖尿病腎病中RACK1(GNB2L1)的表達

GEO數據分析示與對照組比較,糖尿病腎病組腎小管中RACK1(GNB2L1)表達明顯上調,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

2.2 RACK1參與的信號通路

利用KEGG,搜索RACK1參與的信號通路,可見其通過磷酸化STAT1,激活Jak-STAT通路,進一步作用于DNA,引起損傷(見圖2)。

與對照組相比，**P<0.01圖1 人的糖尿病腎病和正常腎臟組織的腎小管中RACK1(GNB2L1)的表達Figure 1 Expression of RAC1 in diabetic nephropathy group and healthy control group

圖2 通過KEGG搜索RACK1參與的信號通路Figure 2 Pathway of RACK1 by KEGG

2.3 HK-2細胞中RACK1、STAT1和STAT3的mRNA水平的表達

real-time PCR示高糖組RACK1、STAT1和STAT3的mRNA水平均較對照組和甘露醇組均明顯升高,差異有統計學意義(P<0.001,見圖3)。

2.4 糖尿病腎病動物模型中蛋白尿變化

與對照組相比,糖尿病腎病組小鼠體質量無明顯變化。糖尿病腎病組血糖水平從STZ注射2周后開始升高,一直維持在較高水平,糖尿病腎病組腎質量/體質量(KW/BW)、尿白蛋白肌酐比(ACR)和24 h尿蛋白定量(UAE)均明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,見圖4)。

與對照組和甘露醇組相比，***P<0.001圖3 高糖刺激的HK-2細胞中RACK1、STAT1和STAT3的表達Figure 3 Expression of RACK1，STAT1and STAT3 in HK-2 cells with high glucose

與對照組比較，***P<0.001，****P<0.000 1圖4 糖尿病腎病小鼠體質量、血糖及蛋白尿變化Figure 4 Changes of body weight，kidney weight/ body weight，blood glucose，ACR and UAE in diabetic nephropathy animal model

2.5 糖尿病腎病動物模型中RACK1、STAT1和STAT3的mRNA水平的表達

real-time PCR示糖尿病腎病組中RACK1、STAT1和STAT3的mRNA水平較正常組明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

2.6 糖尿病腎病動物模型的組織學變化

PAS染色示糖尿病腎病組中腎小球體積增大,系膜增生,腎小管擴張;免疫熒光示p-STAT1染色陽性,主要位于腎小管上皮細胞(見圖6);p-STAT3染色陰性。

與對照組相比，**P<0.01，****P<0.000 1圖5 糖尿病動物模型中RACK1、STAT1和STAT3的表達Figure 5 Expression of RACK1,STAT1 and STAT3 in diabetic nephropathy animal model

圖6 糖尿病腎病動物模型腎小管的組織學變化Figure 6 PAS and immunofluoresence staining of tubule tissues in diabetic nephropathy animal model

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病嚴重的并發癥之一,約50%患者存在糖尿病腎病,是導致終末期腎衰竭的首要原因,但其發病機制目前仍不清楚。糖尿病腎病存在明顯的腎小球病變,文獻報道[3]的關于發病機制的研究多集中于腎小球。Bonventre[1]報道,腎小管病變也是不可或缺的,甚至早于腎小球病變,而且腎小管的病變為主動過程,并不是繼發于腎小球病變,且腎功能的異常與腎小管損害密切相關,Tang等[2]甚至提出了糖尿病腎小管病(diabetic tubulopathy)的概念。近年來許多新的證據提示腎小管,尤其是近端小管,是糖尿病腎病的啟動者,參與糖尿病腎病的發生發展[4]。

RACK1是WD40重復蛋白家族中一員,被報道參與數種疾病的進展[5-7]。有研究表明RACK1過表達抑制成年鼠心肌缺血再灌注的心肌細胞凋亡[8];RACK1下調可抑制食管鱗狀細胞癌體外和體內實驗中細胞增生、侵襲及轉移[9];RACK1能促進TGF-β1調節前纖維通路的激活和肝星狀細胞(HSCs)的轉分化、增生和遷移,RACK1敲除后抑制硫代乙酰胺誘導的肝纖維化[10];本課題組前期試驗第一次證明RACK1在腎纖維化中的作用,說明其可能參與終末期腎臟病的發生發展[11]。但其在糖尿病腎小管病中的作用及機制卻未見報道。故本實驗利用GEO數據庫,初步探討及分析其在糖尿病腎小管病中表達,發現RACK1在人的糖尿病腎病的腎小管中表達升高。

Tang等[12]報道糖化白蛋白可引起近端腎小管細胞中STAT-1升高,可被羅格列酮抑制,降低糖尿病腎病中的促炎癥因子,如ICAM-1、IL-6。Berthier等[13]報道在人糖尿病腎病的腎活檢標本中,STAT-1和STAT-3在腎小管間質中明顯升高。通過KEGG搜索,發現RACK1參與Jak-STAT信號通路發揮作用。故推測RACK1可能是通過Jak-STAT信號通路參與糖尿病腎病的發生發展。

首先本研究證實在高糖刺激HK-2細胞中,RACK1、STAT1和STAT3均明顯升高。結合文獻報道[2]推測糖尿病腎小管病可能是糖尿病腎病的啟動者,推動糖尿病腎病的發生發展。為了進一步驗證其在早期糖尿病腎小管病中的表達及可能的機制,利用鏈脲佐菌素建立糖尿病腎病的模型,我們發現鏈脲佐菌素注射后8周小鼠尿白蛋白肌酐比(ACR)逐漸開始升高,12周ACR小于0.1 μg/mg,糖尿病腎病組腎質量/體質量升高,光鏡下腎小球輕度增大,無系膜增寬等改變,提示處于早期腎小球高濾過狀態,早期糖尿病腎病模型建立成功。real-time PCR提示糖尿病腎病組中RACK1、STAT1和STAT3均明顯升高,由此可見,早期糖尿病腎病中,RACK1明顯升高,組織學免疫熒光染色示腎小管中p-STAT1陽性,但p-STAT3陰性,推測RACK1可能主要是通過磷酸化STAT1而激活下游靶基因來發揮作用的。但要闡明RACK1與p-STAT1的關系,以及在糖尿病腎小管病中的機制,仍需進一步實驗研究。

文獻報道糖尿病腎小管病可能為糖尿病腎病的啟動者,與糖尿病腎病的發生、發展密切相關。本實驗首次發現RACK1在糖尿病腎小管病中的作用,可能通過磷酸化STAT1進而激活Jak-STAT信號通路調節下游靶基因來發揮作用,若可通過干預RACK1及其信號通路,早期阻斷糖尿病腎病的啟動因素——糖尿病腎小管病,將為避免糖尿病腎病的發生發展做出巨大貢獻,為上億糖尿病患者帶來福音。