ABO正反定型不符病例基因測序分析1例

陳 瓊,黎勤云,朱長太

(上海健康醫學院附屬第六人民醫院東院輸血科,上海 201306;*通訊作者,E-mail:zct101@163.com)

ABO血型系統是最早發現的血型系統,正確鑒定ABO血型是保證臨床輸血安全有效的前提。由于生理或病理原因引起ABO抗原或抗體減弱造成的ABO正反定型不符,常常會干擾ABO血型的正確定型,本文以1例血型鑒定出現混合視野進行分析,現報告如下。

1 病例報告

1.1 病例資料

患者,男,74歲,2019年12月9日夜間因上消化道出血伴高血壓入我院急診內科就診。患者重度貧血貌,呼吸急促,無輸血史,血常規檢查白細胞計數7.44×109/L,紅細胞1.42×1012/L,血紅蛋白42 g/L,血小板計數68×109/L。因患者血色素過低,夜班醫生申請輸紅細胞400 ml,輸血前進行常規血型血清學檢測中發現ABO正反定型不符,正定型為抗-A混合視野,反定型B細胞4+,抗體篩查陰性。

1.2 試劑與儀器

凝聚胺試劑為珠海貝索公司生產;ABO、Rh(D)血型定型檢測卡(微柱凝膠法)、低離子抗人球蛋白卡(微柱凝膠法)均為瑞士DiaMedGmbH生產;抗A、抗B血型定型試劑(單克隆抗體)、抗-A1,抗-H、抗-AB試劑、RhD(IgM)血型定型試劑、抗人球蛋白(抗IgG,C3d)檢測試劑、人ABO血型反定型用紅細胞試劑、抗體篩選紅細胞檢測試劑(抗Ⅰ、抗Ⅱ、抗Ⅲ)均為上海血液生物有限責任公司生產;用于配制紅細胞懸液的生理鹽水為山東華魯制藥有限公司生產;Diamed-ID定速離心機、Diamed-ID 37 ℃孵育器為瑞士達亞美公司生產;三用電熱恒溫水浴箱為常州翔天試驗儀器廠生產;KA-2200型離心機為日本久保田生產。

1.3 方法

1.3.1 血型正反鑒定試驗 采用微柱凝膠正反定型血型法進行檢測,后又采用試管法復查。試管法正定型加做抗-A1和抗-AB,反定型做ABO試劑紅細胞和自身對照,所有操作均嚴格按照標準操作規程[1]進行。

1.3.2 H抗原檢測 取玻璃試管一支,加入抗-H試劑和3%受檢者紅細胞懸液各1滴,3 400 r/min離心15 s,觀察結果。同時取新鮮成人B型紅細胞和O型紅細胞做強陽性和弱陽性對照,根據各血型紅細胞H抗原強度由強到弱依次為O型>A2型>B型>A2B型>A1型>A1B型的特點,判斷被檢者紅細胞H抗原是否增強。

1.3.3 不規則抗體篩查試驗 用抗體篩選紅細胞檢測試劑(抗Ⅰ、抗Ⅱ、抗Ⅲ)對患者標本進行不規則抗體篩查。

1.3.4 ABO基因測序 ABO基因測序根據ISBT網站提供的ABO(ISBT 001)等位基因v1.1 171023綜合結果判定(以A101為參考序列),由天津市秀鵬技術開發有限公司完成。

2 結果

2.1 血型血清學檢測結果

血型血清學正定型抗-A檢測結果顯示:在微柱凝膠實驗中可見兩群細胞,在鹽水介質的試管法中為混合視野(見表1)。患者血清學檢測結果懷疑為ABO亞型,不能準確定型,因此需通過分子生物學方法進一步試驗進行準確定型。

表1 患者血型血清學反應格局

方法 正定型反定型 抗-A抗-B抗-A1抗-AB抗-H抗-DA1cBcOc自身微柱法 mf0---4+04+00試管法 2+mf00mf2+4+04+00

mf:在微柱凝膠實驗中可見兩群細胞,在鹽水介質的試管法中為混合視野;-:未測;0:陰性

2.2 抗體篩查和抗人球蛋白實驗結果

抗體篩查、直接抗人球蛋白實驗、間接抗人球蛋白實驗抗體篩查實驗結果均為陰性,排除ABO血型系統以外的不規則抗體;直接抗人球蛋白實驗陰性,排除紅細胞上黏附的自身抗體對血型正定型的干擾;間接抗人球蛋白實驗陰性,排除血清中存在干擾血型反定型的因素(見表2)。

2.3 ABO血型基因檢測結果

ABO基因1-7外顯子測序結果顯示第1-5外顯子未檢測到突變堿基,第6外顯子第261號堿基鳥嘌呤(G)缺失,第7外顯子第467號發生單個堿基替換,胞嘧啶(C)突變為胸腺嘧啶(T),導致第156位氨基酸改變(Pro/Leu)(見圖1)。由此,ABO血型PCR-SSP分型結果證實此例患者ABO基因型為A102/O01。

表2 抗體篩查、直接抗球蛋白和間接抗球蛋白實驗結果

反應條件Ps+ⅠcPs+ⅡcPs+ⅢcPc+PsPc+抗人球蛋白(抗IgG,C3d)鹽水法00000凝聚胺法0000-微柱凝膠法0000-

Ps:患者血清;Pc:患者紅細胞;-:未測;0:陰性

圖1 ABO基因外顯子6和外顯子7測序結果

3 討論

紅細胞血型是指紅細胞膜上特征性抗原的類型。截止到2009年,國際輸血協會(ISBT)已經確認了308個特異性血型抗原,其中有270個分屬于明確的30個血型系統[2]。但ABO血型仍是人類血型系統中抗原免疫原性最強的一個血型系統,因此ABO血型在輸血工作中是最重要的,也是最具有臨床意義的。正常情況下,ABO血型系統的抗原強度不會輕易發生改變[3]。由于紅細胞血型抗原表達發生改變或血清中抗體改變,都會使血型判斷困難或者判斷錯誤,不能輕易輸血[4]。

本案例中,血清學檢測出混合視野(即紅細胞凝集成小凝塊,并被大部分游離的非凝集細胞包圍[5]),首先考慮排除其他原因造成的混合視野現象,如嵌合現象、并通過健康征詢排除移植史、白血病等疾病影響,患者近期無輸血史,排除了輸錯血造成的混合視野現象。

雖然血清學懷疑為ABO亞型,但通過基因檢測技術確定了上述樣本為A型,基因分型為A102/O01。根據文獻報道A102等位基因與A101等位基因相比只是在467位的單個堿基替換(C467T,Pro/Leu),兩者翻譯的糖基轉移酶活力沒有顯著性差異[6]。O01等位基因在第6外顯子nt261缺失,任何一個等位基因只要是包括了這個突變,不管它別的外顯子中(第4、6、7顯子)什么突變,都會導致ABO基因產物——催化乙酰半乳糖或半乳糖轉移到寡糖受體上的能力完全喪失。由于ABO基因的多態性,除了常見的第6、7外顯子上的基因突變引起抗原減弱外,第6、7外顯子以外的基因變異或轉錄結構以及調控區域的異常都有可能導致A抗原減弱[6]。池泉等[7]報道ABO血型抗原的合成機制受多種因素影響,不同個體間即便含有相同的等位基因或突變也可能有著不同的血清學表現。所以進一步研究這些領域的分子機制將有助于理解有相同等位基因的個體卻產生不同的血清學表現。

綜上所述,臨床上血清學方法是血型鑒定的經典方法,適用于日常的血型定型工作。當遇到血型正反定型不一致時,不要輕易報告亞型,基因測序可以對患者血型進行基因分型,并有可能發現新的突變位點。探討疑難血型的發生機制,是對血清學鑒定方法的有效且重要的補充。因此,在血型鑒定工作中將血清學鑒定和基因測序兩種方法有效結合,對于正確鑒定血型和保證臨床安全輸血具有重要意義。