不同地區(qū)草烏種子中生物堿含量的測(cè)定與分析

山 丹 屈璐璐 李曉杰 馬一鳴 王俊杰

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010011)

草烏(蒙藥名泵阿)為毛茛科(Ranunculaceae)烏頭屬(Aconitum)多年生草本植物，又叫北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)[1]，是現(xiàn)階段開(kāi)發(fā)利用的蒙藥材之一。蒙藥以干燥塊根及干燥葉入藥[2]，夏季葉茂盛花未開(kāi)時(shí)采收，除去雜質(zhì)，及時(shí)干燥[3]。具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛之功效，味辛、苦、熱，有大毒[4]。草烏入藥的有效化學(xué)成分為烏頭堿(aconitine)、次烏頭堿(hypaeonitine)、新烏頭堿(mesaeonitine)、苯甲酰烏頭原堿(benzoylaconine)、苯甲酰新烏頭原堿(benzoylmesaconine)、苯甲酰次烏頭原堿(benzoylhypaconitine)等[5～7]，藥理研究證明草烏具有鎮(zhèn)痛、消炎、局部麻醉、抗腫瘤等作用[8]。草烏分布較廣，因產(chǎn)地、植被等環(huán)境因素，各地草烏藥用塊根及葉子的生物堿類(lèi)含量差別較大[9]，所以用藥前測(cè)定或了解其生物堿含量對(duì)保障藥材使用安全具有重要意義。目前，草烏種子的應(yīng)用僅在植物繁殖方面[10～12]，用于藥用方面的研究甚少，對(duì)于草烏種子是否含有生物堿成分，是否具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究采用HPLC法[13～16]對(duì)不同產(chǎn)地草烏種子的生物堿含量進(jìn)行了測(cè)定與分析，為草烏種子的綜合利用提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(1525色譜泵，2428雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，Breeze工作站)；超聲波清洗器(SB25-12DTDN型寧波新芝生物科技股份有限公司)；循環(huán)多用真空泵(SHB-3型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52型，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

烏頭堿對(duì)照品(批號(hào):302-27-2)、新烏頭堿對(duì)照品(批號(hào):2752-64-9)、次烏頭堿對(duì)照品(批號(hào):6900-87-4)、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品(批號(hào):63238-67-5)、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品(批號(hào):63238-66-4)(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院提供)。甲醇、三乙胺為色譜純，水為超純水，乙酸乙酯、異丙醇等試劑，其他為分析純。

草烏種子采集于內(nèi)蒙古地區(qū)(草烏的產(chǎn)地及采集時(shí)間見(jiàn)表1)。由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院王俊杰教授鑒定為蒙藥草烏。

表1 研究材料

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Supersil ODS2 5 μm(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1 mol·L-1，三乙胺(75∶25)；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：35℃。色譜圖詳見(jiàn)圖1～4。

圖1 1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰次烏頭原堿；3.新烏頭堿；4.烏頭堿；5.次烏頭堿對(duì)照品HPLCFig.1 1.Standards for HPLC reference of benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

圖2 草烏種子供試品HPLC圖(產(chǎn)地內(nèi)蒙古通遼市扎魯特旗) 1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰次烏頭原堿；3.新烏頭堿；4.烏頭堿；5.次烏頭堿Fig.2 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Zhalute of Tongliao City,Inner Mongolia) 1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

圖3 草烏種子供試品HPLC圖(產(chǎn)地內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗) 1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰次烏頭原堿；3.新烏頭堿；4.烏頭堿；5.次烏頭堿Fig.3 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Alu Kerqin of Chifeng City,Inner Mongolia) 1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

圖4 草烏種子供試品HPLC圖(產(chǎn)地內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗) 1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰次烏頭原堿；3.新烏頭堿；4.烏頭堿；5.次烏頭堿Fig.4 HPLC chromatogram of alkaloids in A.kusnezoffii seeds(Balin of Chifeng City,Inner Mongolia)1.Benzoyl neoaconitine; 2.Benzoyl hypoaconitine; 3.Neoaconitine; 4.Aconitine; 5.Hypoaconitine

2.2 對(duì)照品溶液制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取苯甲酰新烏頭原堿1.02 mg、苯甲酰次烏頭原堿1.15 mg、新烏頭堿0.98 mg、烏頭堿1.85 mg和次烏頭堿1.06 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 供試品溶液制備

精密稱(chēng)取草烏種子樣品粉末(過(guò)40目篩)各1.0 g，置具塞錐形瓶中，用氨試液濕潤(rùn)20 min，精密加乙酸乙酯和異丙醇混合溶液(1v∶1v∶1v)50 mL，密塞，搖勻，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱(chēng)定重量，用乙酸乙酯和異丙醇混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤?0%鹽酸水3 mL，溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

表2 2種單酯型生物堿線(xiàn)型范圍考察結(jié)果

Table 2 The linear range investigation results for two types of monoester alkaloids

次數(shù)Number苯甲酰新烏頭原堿Benzoyl neoaconitine苯甲酰次烏頭原堿Benzoyl hypoaconitine進(jìn)樣量Injection amount(μg)峰面積Peak area進(jìn)樣量Injection amount(μg)峰面積Peak area10.204307520.233203420.408699980.464818830.6121051900.696406740.8161447210.928121451.0201847681.1510037961.2242196791.38115863

表3 3種雙酯型生物堿線(xiàn)型范圍考察結(jié)果

表4 加樣回收率結(jié)果

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，分別注入液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：苯甲酰新烏頭原堿Y=186 061x-6 996.3，r=0.999 6，線(xiàn)性范圍0.204～1.224 μg；苯甲酰次烏頭原堿Y=16 939x+14 338，r=0.999 1，線(xiàn)性范圍0.230 0～1.380 0 μg；新烏頭堿Y=950 912x-17 973，r=0.999 6，線(xiàn)性范圍0.196 0～1.176 0 μg；烏頭堿Y=4E+06x-16 827，r=0.999 1，線(xiàn)性范圍0.037 0～0.222 0 μg；次烏頭堿Y=5E+06x-21 405，r=0.999 1，線(xiàn)性范圍0.021 2～0.127 2 μg由此可見(jiàn)，對(duì)照品進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(表2～3)。

2.5 精密度試驗(yàn)

取供試樣品溶液10 μL，按2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定5種生物堿的峰面積積分比值計(jì)算RSD，結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿RSD值均在1.4%～2.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.3項(xiàng)下供試品溶液，精密稱(chēng)取10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，分別于0，2，4，6，10，14，16，24 h依次進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿RSD值均在1.3%～3.1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批草烏種子藥材，按2.3下方法制備成供試品溶液6份，精密吸取10 μL，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿RSD值均在0.88%～2.36%，表明特征圖譜的測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的樣品粉末0.5 g，共6份，分別精密稱(chēng)取相應(yīng)量的烏頭堿類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率(見(jiàn)表4)。

2.9 樣品測(cè)定

按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液3份，精密吸取10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)內(nèi)蒙古通遼魯北、赤峰天山和賽罕烏拉草烏種子有效成分進(jìn)行含量測(cè)定(見(jiàn)表5)。

表5 3種不同產(chǎn)地草烏種子中烏頭堿類(lèi)成分含量

Table 5 Content of alkaloids inA.kusnezoffiiseeds from three different habitats(mg·g-1)

產(chǎn)地Origin赤峰市阿魯科爾沁旗Alu Kerqin of Chifeng City赤峰市巴林右旗Balin of Chifeng City通遼市扎魯特旗Zhalute of Tongliao City苯甲酰新烏頭原堿Benzoyl neoaconitine8.22±0.06a7.64±0.06b7.85±0.06b苯甲酰次烏頭原堿Benzoyl hypoaconitine0.68±0.01b0.49±0.01c1.41±0.08a總烏頭原堿Total aconitine8.84±0.03a7.95±0.06b8.91±0.07a新烏頭堿Neoaconitine0.38±0.01b0.58±0.02a0.28±0.01c烏頭堿Aconitine0.72±0.01b1.09±0.06a0.66±0.01b次烏頭堿Aconitine reference0.49±0.01a0.15±0.01c0.25±0.01b總雙酯型生物堿Total diester alkaloids1.31±0.05b1.65±0.05a1.19±0.05b

3 討論

(1)邵財(cái)[17]等研究認(rèn)為，草烏藥材(塊根)中雙酯型生物堿的量明顯高于單酯型生物堿。本文研究結(jié)果顯示，在草烏種子中單酯型生物堿的量高于雙酯型生物堿，其中雙酯型烏頭堿含量為新烏頭堿0.296 2～0.596 1 mg·g-1、烏頭堿0.636 5～0.963 1 mg·g-1、次烏頭堿0.153 4～0.486 3 mg·g-1，單酯型烏頭堿含量為苯甲酰新烏頭原堿7.512 6～8.256 3 mg·.g-1、苯甲酰次烏頭原堿0.489 8～1.440 9 mg·g-1。這一結(jié)果表明，草烏種子與塊根中單酯型生物堿和雙酯型生物堿的含量變化規(guī)律相反。

(2)張艷[18]測(cè)定了不同產(chǎn)地的3批草烏塊根中生物堿的含量，結(jié)果表明，草烏中主要含有烏頭堿及苯甲酰烏頭堿，其他生物堿的含量極低，但未對(duì)不同產(chǎn)地材料烏頭堿含量變化規(guī)律進(jìn)行比較分析。本研究結(jié)果顯示，草烏種子與草烏藥材中的含量不一致。種子中主要含有苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭堿和烏頭堿，烏頭堿含量居中，次烏頭堿等含量最少。不同產(chǎn)地總烏頭堿含量和單體烏頭堿含量都存在差異。總烏頭堿含量通遼市>赤峰市。單體烏頭堿含量的變化規(guī)律是苯甲酰新烏頭原堿含量依次為赤峰市阿魯科爾沁旗>通遼市扎魯特旗>赤峰市巴林右旗；苯甲酰次烏頭原堿含量為通遼市樣品的明顯高于赤峰市2個(gè)產(chǎn)地的樣品。次烏頭堿含量為變化赤峰市阿魯科爾沁旗>通遼市扎魯特旗>赤峰市巴林右旗的樣品。烏頭堿及新烏頭堿均為赤峰市2個(gè)產(chǎn)地的含量高于通遼市的樣品含量。

(3)隨志剛[19]等研究表明，在草烏藥材中使用流動(dòng)相為甲醇-0.1 mol·L-1∶三乙胺(65∶35)配比條件的酸堿性適中，適用性強(qiáng)，峰形穩(wěn)定。本研究在草烏種子中使用此方法時(shí)，流動(dòng)相跑機(jī)器時(shí)發(fā)生突然飄高，不穩(wěn)定的現(xiàn)象，對(duì)色譜峰造成干擾。為了克服這種現(xiàn)象，本研究對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整為甲醇-0.1 mol·L-1∶三乙胺(75∶25)，調(diào)整后克服了基線(xiàn)飄高現(xiàn)象，且5種被測(cè)組分分離度較好，峰展寬適中，效果顯著[20]。表明測(cè)定草烏藥材和種子時(shí)的流動(dòng)相比例不同；測(cè)定草烏種子時(shí)流動(dòng)相甲醇比例調(diào)高，三乙胺比例調(diào)低為最佳。