陰陽離子表面活性劑對無花果葉中有效成分提取工藝優化及初步功能評價

孟 瑤 余 蓮 秦祥宇 劉 暢 王澤霖 趙春建 付玉杰*

(1.東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.東北林業大學林業生物制劑教育部工程研究中心，哈爾濱 150040； 3.東北林業大學化學化工與資源利用學院，哈爾濱 150040)

無花果(FicuscaricaL.)英文名為fig，外觀只見果不見花所以在民間稱之為無花果。雖然其果實備受食品市場的歡迎，但其葉子通常作為果實加工的副產品而丟棄處理，在產生大量的生物質資源浪費的同時也因為不恰當的處理對環境造成了一定的影響。無花果葉具有多重藥理活性，包括抗氧化[1]，抗菌，抗腫瘤[2]，抗蟲[3]，抗病毒以及降血糖降血脂[4～5]等，在醫療及農業等領域具有較大的開發潛能。無花果葉中含有豐富的天然活性物質[6]，所以開發出一種高效的提取無花果葉中有效物質的方法是十分必要的。

中草藥中有效物質提取的一種新興手段——微波輔助提取技術，是通過使用適當的溶劑在微波反應器中從天然植物、礦物或動物組織中獲取目標產物的技術和方法[7]。微波輔助提取法具有快速高效，加熱均勻[8]等優點，同時由于微波設備操作簡單，且節省溶劑和提取所用時間，所有參數均可以數據化，能夠與制藥現代化接軌[9]，在提取過程中溫度較低，不易糊化[10～11]，后續的處理也十分方便。經上述可得，微波輔助提取工藝提取效率高，在化工生產中具有廣闊的應用前景。

傳統的有機試劑在天然產物的提取中占主導地位，但是能耗大，產率低是其亟需解決的問題。表面活性劑由于具有兩親性，在提取極性較小的目標產物后還可以充分溶解在極性較大的水溶液中，這是其他提取劑所不能比較的[12]。目前，表面活性劑在天然產物提取上的應用還處于初步階段，但是由于其提取效率高，短時間內能提取完全，且用量較低，綜合經濟效益高等優點受到了越來越多的關注。同時，因為其還具有良好的復配性質[13]，可作為一種新型的環保綠色可替代的提取劑[14～15]。本實驗采用了陰陽離子表面活性劑進行復配，更好地對無花果葉中的不同化合物進行捕捉，聯合微波輔助對無花果葉中的有效成分進行提取，通過單因素法對最佳的提取工藝進行了研究，本方法操作簡單且溶劑用量較少，同時也能有效地提高最終粗提物的品質，為天然產物的開發利用提供了必要的科學依據與實驗參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

無花果葉采摘在山東省威海市；十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，十六烷基三甲基銨氯化物(CTAC)，二十六烷基二甲基溴化銨(DHAB)，十二烷基硫酸鈉(SDS)和辛基硫酸鈉(SOS)均購買于Aladdin生物技術有限公司；分析級的乙醇購自天津市Kermel試劑公司；1,1-二苯基-1-甲基苯并肼(DPPH)，抗壞血酸(Vc)和丁基羥基甲苯(BHT)購自Sigma-Aldrich(德國)；用Milli-Q水凈化系統制備去離子水；補骨脂素以及佛手柑內酯的標準品(>98%)購買于上海源葉生物技術有限公司。

儀器與設備：旋轉蒸發儀型號為RE25AA；BT25S型電子分析天平；W891型烘干機；MAS-Ⅱ型微波儀；22R型高速離心機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

選取七、八月份新鮮無明顯枯萎和蟲害的無花果葉于陰涼干燥處陰干直到重量不變，粉碎至60目后于4℃下放置在密封袋里進行低溫避光保存。取用時應將密封袋取出冰箱放置一段時間，待粉末達到室溫后再打開袋子進行稱重，避免無花果葉子吸潮影響稱量。

1.2.2 組成成分的研究

本實驗采用高效液相色譜對無花果葉有效成分進行分析，HPLC分析方法是在具有Diamonsil C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikma，北京)的Agilent 1200系列液相色譜系統上開發的。以下為補骨脂素以及佛手柑內酯的標準曲線。

表1 補骨脂素和佛手柑內酯回歸數據

Table 1 Regression data，LODs and LOQs forpsoralen and bergapten

分析物Analyte標準曲線Calibration curve相關系數R2(n=8)線性范圍Linearity range(μg·mL-1)檢出限LOD(μg·mL-1)定量限LOQ(μg·mL-1)補骨脂素PsoralenY=83.25X+1.870.99995～1000.170.52佛手柑內酯BergaptenY=138.25X-2.240.99985～1000.200.62

注：X.標準品濃度(μg·mL-1)；Y.峰面積

Note:X.Standard concentration(μg·mL-1)；Y.Peak area

1.2.3 陰陽離子表面活性劑聯合微波輔助提取

準確稱取1.0 g無花果葉粉末溶于一定量的水中，加入配制的一定比例的表面活性劑溶液后混勻直到溶液穩定，置于微波提取器中，按照一定條件進行微波提取，反應結束后取出，定容，過濾，離心，并用微孔濾膜過濾后進行HPLC分析其成分及含量，重復3次取平均值。

1.2.4 實驗過程的優化

不同的實驗條件對最終的提取率有一定程度的影響，此處分別對包括復配的表面活性劑的種類及其濃度、液固比、微波時間及溫度等實驗參數進行優化，每組實驗重復3次取平均值。其中無花果葉中主要目標成分的提取率的計算為

提取率(mg·g-1)=(C×V)/M

(1)

式中：C為樣品溶液中所測物質的濃度(mg·mL-1)；V為樣品溶液體積(mL)；M為無花果葉粉干重(g)。

1.3 初步功能性評價

1.3.1 抗氧化性質檢測

DPPH抗氧化性能力的測定：取1 mL樣品濃度為0.004%的DPPH乙醇溶液于黑暗條件下與樣品溶液混合，待穩定后再與一定體積的乙醇溶液混合，黑暗條件下靜置，70 min后在517 nm下進行吸光度測定，Vc作為對照，重復測定3次。

抗氧化能力(Ip)=[(AA-AB)/AB]×100

(2)

式中：AA與AB分別為70 min后待測樣品和空白的吸光度值。

ABTS抗氧化能力的測定：量取200 μL的ABTS工作液與10 μL的樣品溶液混合，待溶液均勻后在黑暗條件下靜置2～6 min后于734 nm處測定吸光度值，重復測定3次。

還原力的測定：量取500 μL的磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1，pH6.6)同相同體積的1%[K3Fe(CN)6]溶液混合，加入相同體積的樣品溶液，于50℃下水浴反應25 min后快速取出，加入冷水使其快速冷卻，加入相同體積的10%三氯乙酸，3 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液500 μL同相同體積的蒸餾水及FeCl3混和均勻，在靜置10 min后在700 nm下進行測定吸光度，重復測定3次。

1.3.2 穩定性檢測

在生產應用中，產品的儲備時間也是一個衡量產品標準的重要指標。眾所周知，無花果葉中的主要成分補骨脂素是一種光敏感型的化合物，經常會發生不可逆轉的降解。但是其本身也是十分重要的抗皮膚炎癥等的有效物質，所以在生產過程中保留原有物質本身性質的同時提高本身的抗降解率也是十分必要的。所以本實驗衡量了相同提取含量下，加入一定量的復配型表面活性劑，與原材料進行對比，研究在相同條件下，不同天數無花果葉中主要物質的含量變化情況。

具體實驗操作步驟：取相同體積的樣品溶液進行放置實驗，分別測得在第1、3、5、7天中，補骨脂素的含量與最開始原始的含量進行百分比測試。制定的降解折線圖能直觀地對比出二者的穩定性能力。

2 結果與分析

2.1 單因素結果選擇

2.1.1 表面活性劑種類對無花果葉中目標成分提取率的影響

為了獲得最佳的提取效果，如圖1所示，選擇了4種復配的表面活性劑體系進行篩選，分別為DTAB/SDS，CTAB/SOS，CTAC/SOS和DHAB，可以發現表面活性劑的加入與常規水溶液提取有較明顯的提高[11]，當使用DTAB/SDS作為萃取溶劑時，所有分析物的提取效率達到最高。DTAB/SDS體系具有與陰離子和陽離子表面活性劑相同的烷基鏈長，與其他研究的體系相比，這可能導致更緊密、更穩定的極性層聚集體。此外，DTAB/SDS體系的獨特性質以及與目標分析物的特殊相互作用可能更加有助于提取，反觀，DHAB的提取效率最低，這可能是由于DHAB的電荷密度較低的緣故。與帶相反電荷的表面活性劑形成的其他體系相比，靜電相互作用弱，因此，選擇DTAB/SDS體系為最佳的提取溶劑。

圖1 表面活性劑種類對目標產物提取率的影響Fig.1 The effect of the formulated surfactant types on the extraction yield of target compounds

圖2 表面活性劑濃度對目標產物提取率的影響Fig.2 The effect of the formulated surfactantconcentrations on the extraction yield of target compounds

圖4 提取時間對目標產物提取率的影響Fig.4 Effect of differentextraction time on the extraction yield of target compounds

圖3 液固比對目標產物提取率的影響Fig.3 Effect of different liquid to solid ratio on the extraction yield of target compounds

圖5 提取溫度對目標產物提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperatureon the extraction yield of target compounds

2.1.2 表面活性劑濃度對無花果葉中目標成分提取率的影響

為了獲得最高的提取效率，在相同實驗條件下，在0.1%～5.0%(w/v)的范圍內對表面活性劑濃度進行了研究。結果如圖2所示，目標化合物的提取量隨著濃度增加呈正態分布趨勢。當濃度過低時可能導致與底物接觸不完全，達不到徹底的提取。增加DTAB/SDS的濃度可以通過增強氫鍵與目標分析物的疏水—親水相互作用來提高提取率。但是，將濃度進一步從1%(w/v)增加到5%(w/v)會導致目標分析物的提取效率降低或保持不變。分析原因可能是在1%(w/v)的濃度附近達到了動力學提取平衡，進一步增加濃度可能使原表面活性劑單體開始沉淀。此外，過高的濃度會導致溶液本身較為粘稠，傳質受到阻礙，導致分析物在水相中的溶解度受到影響。基于上述原因，選擇1%(w/v)作為DTAB/SDS提取目標產物的最佳濃度。

2.1.3 液固比對無花果葉中目標成分提取率的影響

如圖3所示，當提取時間固定時，目標成分的提取率隨液固比的變化呈先增加后有輕微下降。然而當液固比較小時，材料底物與表面活性劑的接觸不夠充分，提取效率就較低。但是當液固比過大時，不僅會造成不必要的浪費，還會使得溶液體系稀釋過度，表面活性劑在短時間內捕獲目標化合物不夠完全，導致提取率輕微下降。如圖3所示，當液固比達到30∶1時，可以達到較高的提取效率同時還不會造成過多的浪費，符合綠色節能的發展理念。

2.1.4 時間對無花果葉中目標成分提取率的影響

從圖4中可以看出，提取時間在10 min時候呈現出了最大值，補骨脂素與佛手柑內酯分別為15.21與3.57 mg·g-1。隨后在15 min后又有輕微的下降，分析原因可能是由于積累的時間導致了容器內溫度的增加，過熱的溫度會對目標化合物的結構產生破壞從而降低最終的產量。而在5 min時產量較低，應該是由于底物與提取溶劑的接觸時間不夠充分，在較短的時間內不能夠完全地將目標化合物捕獲，導致最終的產量下降。但是過長的時間不僅僅會造成能源的浪費，反而會引發能量積累對最后的產量產生不利的影響。所以選取最適合的提取時間10 min，不僅會減少能量消耗，縮短時間提高效率，還可以最大程度地將目標化合物提取出來。

2.1.5 溫度對無花果葉中目標成分提取率的影響

溫度是影響分子運動快慢的一個重要因素，所以，探索不同溫度下對提取效率的影響是十分必要的。從圖5中可以看出，在溫度30℃、40℃、50℃、60℃的情況下，總提取效率呈現先上升后接近平緩的趨勢。其中，當溫度達到40℃時，補骨脂素及佛手柑內酯的提取率達到了最大(見圖5)，分別為15.37和3.59 mg·g-1。分析原因可能是在較低的溫度下，分子間的運動較慢，不利于表面活性劑分子與目標化合物的接觸，阻礙了反應高效、有序地進行。隨著溫度的升高，分子間的運動加快，在一定時間內接觸的更加充分徹底，能夠讓反應更加完全。但是隨著溫度的進一步增加，總提取效率并沒有呈現出線性增加，而是更加趨近于平緩。這就說明了在一定時間內，在高于40℃的條件下，分子之間的接觸已經達到了完全的充分，過高的溫度可能會加快分子之間運動的進行但是并不會提高最終的產量。此外，過高的溫度可能會對表面活性劑內部的復配造成化合鍵的斷裂，影響了與化合物之間的絡合。最重要的是，溫度過高還可能造成無花果葉中主要成分的降解，影響最終的獲取率。所以綜合以上的分析，本實驗采用40℃作為最適合的提取溫度，在保證最高提取效率的同時減少能源損耗，達到綠色發展的理念。

2.2 初步功能評價

2.2.1 抗氧化性質的研究

通過抗氧化實驗的測定可以得出的結論是，在加入了一定濃度的陰陽離子復配型表面活性劑后，無花果葉的粗提物的抗氧化能力有明顯的提升，其中溶液的DPPH的IC50由0.107 mg·mL-1下降到了0.095 mg·mL-1，ABTS自由基清除能力也由0.503 mmol·g-1上升到了0.794 mmol·g-1，以BHT為對照，還原力IC50值降低了0.038 mg·mL-1。所以，不僅作為一種有效的提取劑，表面活性劑還可以作為一種綠色的抗氧化劑，保證所需要的活性成分在儲備和運輸過程中得到較好的保護，為許多工業化生產，比如化妝品，藥品等生活必需品的制備，提供了有價值的依據和參考。

表2 無花果葉不同溶劑提取物的抗氧化結果

Table 2 Antioxidant results of different solvent extracts of fig leaves

商品名Trade nameDPPH IC50(mg·mL-1)ABTS(mmol·g-1Trolox)Reduction ability IC50(mg·mL-1)無花果葉粗提物Crude fig leaf extract0.1070.5030.183無花果葉粗提物與表面活性劑Fig leaf crude extract and surfactant0.0950.7940.145Vc0.0641.034—BHT——0.136

圖6 不同提取溶液的穩定性研究Fig.6 The study on the stability of extraction solution

2.2.2 穩定性的比較

無花果葉中補骨脂素為光敏感型物質，如果沒有進行遮光處理十分容易降解。由實驗得知，與初始濃度相比，沒有加入表面活性劑的一組在1、3、5、7 d分別為80%、50%、40%和35%，而加入了表面活性劑的一組則為83%、70%、60%以及50%。從圖3可以看出來，無花果葉粗提物與表面活性劑的組合整體下降趨勢線的斜率要小于單獨的無花果葉粗提物，說明在相同的條件下，表面活性劑的加入會大大減緩原本極容易降解的物質——補骨脂素的消失，也說明了表面活性劑可以作為一種穩定溶劑，在3～7 d，它的添加使無花果葉粗提物的活性物質的穩定性平均提高了20%，分析原因可能是由于表面活性劑的加入增加了溶液的不透光性，光敏性物質比如補骨脂素以及佛手柑內酯等受到了較少的影響。還可能是因為表面活性劑的加入降低了整體溶液的表面張力，所以與空氣接觸的面積相對較低，不容易被空氣中的氧化物質所氧化。同時研究2.2.1也表明，表面活性劑的加入會導致整個體系的抗氧化能力的增強，所以對目標化合物的降解具有一定程度的緩沖作用。在現代醫療美容等行業中，表面活性劑的加入會大大的降低產品的損失，提高產品使用效率，從而經濟和綠色發展也得到了較好的效果，具有較大的開發價值。

3 結論

本研究完成了陰陽離子復配表面活性劑溶劑微波輔助提取無花果葉中主要目標成分的提取工藝的優化，最佳工藝條件為1%(w/v)的十二烷基硫酸鈉(SDS)與十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，液固比為30∶1，提取時間為10 min，溫度為40℃，在此條件下，補骨脂素與佛手柑內酯的提取量分別為15.37和3.59 mg·g-1。通過體外抗氧化實驗以及穩定性實驗對陰陽離子復配型表面活性劑的功能進行初步評價，為合理、有效開發利用無花果葉資源提供了必要的科學依據，同時對植物中天然有效目標產物的綠色高效提取以及功能評價具有十分重要的理論指導意義。