應用iTRAQ 技術篩選肺葉切除術患者單肺通氣前后血清差異表達蛋白質

張浩，李明，李鵬

(濰坊市益都中心醫院，山東 濰坊)

0 引言

單肺通氣(one-lung ventilation，OLV) 是一種經支氣管導管僅利用單側肺( 非手術側肺) 進行通氣的方法，一方面能夠隔離患側肺，避免患側肺對健側肺的污染，另一方面可以使兩側肺分別通氣，患側肺萎陷停止呼吸，為手術提供良好的視野。近年來，隨著胸外科手術的快速發展及胸腔鏡技術的推廣，OLV 的應用也越來越廣泛[1]。但是OLV 期間術側肺的血液未能得到充分的氧合導致肺內分流的增加，進而引起肺組織缺氧，導致低氧血癥，造成肺組織細胞的損傷和功能損害。此外長時間的肺萎陷、多次的肺復張以及術中手術操作對肺組織的牽拉、擠壓等也會對肺組織造成一定的程度的損傷，甚至可以引起呼吸機相關性肺損傷(ventilator associated lung injury，VALI)導致肺部并發癥甚至死亡率的增高。iTRAQ 技術是近年來開發的一種可同時對八組樣本進行定性和相對定量分析的蛋白組學技術，結合多維液相色譜和串聯質譜技術現已成為差異蛋白質組學定量研究的主要工具，廣泛的應用于腫瘤生物學標志物的尋找等領域。本研究旨在利用iTRAQ 技術篩選肺葉切除手術患者單肺通氣前后發生差異表達的蛋白，為進一步研究單肺通氣肺損傷的發病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

5800 MALDI-TOF/TOF 質 譜 儀( 美 國)、Nano-Tempo LC 點靶儀(加拿大)、iMark 型酶標儀(美國)、Agilent 1200 series 液 相 色 譜 儀( 美 國)；iTRAQ 8 標Buffer 試 劑 盒( 美國)、iTRAQ 8 標試劑盒(美國)、胰酶(美國Promega 公司)、Agilent Buffer A 和B(美國)、Multiple Affinity Removal System(MARS) Human 14 親和層析柱(美國)。

1.2 樣本采集及分組

血清樣本取自2011 年3 月至2011 年10 月于東南大學附屬江陰市人民醫院胸外科行肺葉切除術患者。入選標準：ASA Ⅰ或Ⅱ級；1 周內無感染病史，無皮質激素和抗生素使用史；患者肺功能正常或僅有輕度的通氣功能障礙；無肝腎功能障礙。排除標準：因個體差異或者體位問題導致雙腔管管口定位不良，血氧飽和度無法維持在90%以上；OLV 時間不足2h 或者大于4h；術中出現大的血流動力學波動。各例手術均采用相同的麻醉方法、麻醉機和監護設備，由相同的麻醉醫生進行操作。標本采集經過醫院倫理委員會批準和患者本人或

者家屬的知情同意，在手術開始前和手術結束后即時取中心靜脈血5mL 于促凝管內，分別記為OLV 術前組和OLV 術后組，室溫放置30min，4℃恒溫離心機3000r/min 離心20min，取上層血清，置于-80℃保存。

1.3 去除高豐度蛋白

-80℃保存的血清冰上復溶，各組的20 例樣本分別以5μl 等體積混合后，使用免疫親和色譜柱緩沖液A(Buffer A)稀釋4 倍，0.22μm 孔徑離心濾膜16000g 離心1min 去除顆粒物質。單次上樣量80μl，應用MARS HUMAN-14 免疫親和色譜柱去除血清中的白蛋白、IgG、轉鐵蛋白等14 種高豐度蛋白。過柱后得到的低豐度蛋白餾分采用5K MWCO 的離心濃縮器進行濃縮，濃縮后采用BCA 定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.4 胰酶酶解和iTRAQ 標記

各組樣本分別取100μg 蛋白進行變性、還原、半胱氨酸修飾和胰酶酶解等處理后，采用iTRAQ 試劑進行標記OLV術前組和OLV 術后組分別采用113 和114 標記。

表1 術前組和術后組比較，上調或者下調差異1.5 倍以上的蛋白質

1.5 二維液相色譜-串聯質譜分析

標記后的多肽混合物使用Spin Colum 進行脫鹽處理后，應用配有強陽離子交換(SCX)色譜柱的液相色譜儀進行第一維色譜分離，然后使用裝有反相-c18 柱的TempoTM LCMALDI 點靶儀進行第二維反相色譜分離并點靶。點靶完成后使用MALDI-TOF/TOF 5800 型質譜儀進行質譜分析。

1.6 數據分析

質譜數據分析使用ProteinPilot 軟件，搜索IPI 人類蛋白質數據庫。選擇可信度≧95%或者Protscore ≧1.3 的蛋白進行報告，以113 為對照，比值≧1.5 或者≦0.67 作為閾值選取差異蛋白。差異蛋白的注釋和分類使用DAVID 的功能注釋，其中選擇GO(gene ontology)的生物過程、細胞成分和分子功能注釋對蛋白進行分類，選擇KEEG 的通路數據庫對蛋白所涉及的通路進行分類和富集分析。

2 結果

2.1 質譜鑒定結果

質譜數據利用Protein Pilot 軟件搜庫得到可信度大于95%即Unused Protscore ≧1.3 的蛋白189 種，其中差異表達的蛋白42 種，較通氣前上調的蛋白有20 種，下調的蛋白有22 種，見表1。

2.2 生物學功能分析

對單肺通氣過程中發生差異表達的42 種蛋白進行基因功能聚類分析(gene ontology，GO)和KEEG 通路分類和富集分析后發現這42 種蛋白主要參加急性炎癥反應、補體系統的激活、細胞凋亡調節、蛋白水解作用、趨化反應等生物學過程；細胞組分主要為血漿膜蛋白、核孔復合體、膜攻擊復合物、細胞質膜結合蛋白等；分子功能主要以結合和催化功能為主；富集到的通路主要為趨化因子和細胞因子介導的炎癥信號通路、凝血級聯反應等。

3 討論

隨著對單肺通氣肺損傷信號轉導通路研究的深入，發現不論是缺血缺氧性損傷、機械牽張性損傷還是生物性損傷其對肺組織的損傷作用大都轉歸到細胞因子和趨化因子引起的炎癥反應上，了解這些細胞因子或趨化因子的變化規律對更加深入的闡釋肺損傷的發生機制具有重要的意義。iTRAQ 技術能夠動態、整體地考察疾病發生、發展過程中蛋白質種類、數量的改變，對進一步闡釋疾病的發病機制具有重要的意義。本研究利用該技術對肺葉切除手術患者單肺通氣前后的血清進行分析，發現了42 種差異蛋白。

本研究結果中，單肺通氣后表達上調的蛋白中有3 個為急性相反應蛋白，分別為α1-抗胰蛋白酶、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、C 反應蛋白(CRP)。α1-抗胰蛋白酶由肝臟產生，是人體內血清蛋白溶解酶的主要抑制物。正常人肺組織內，分解肺組織的蛋白酶與抑制蛋白酶活性的α1-抗胰蛋白酶之間處于動態平衡狀態，從而維持肺組織正常的結構免于破壞。當肺部炎癥時，血清中中性粒細胞和肺泡巨噬細胞釋放出大量的彈性蛋白酶和基質金屬蛋白酶，α1-抗胰蛋白酶也隨之升高。揭志軍[2]等研究發現預防性靜脈注射α1-抗胰蛋白酶能夠提高體內抗蛋白酶的活性，減輕中性粒細胞蛋白酶(NE)對細胞外基質和血管屏障的損傷，減輕血管通透性的增高，使肺損傷減輕。C-反應蛋白和SAA 是敏感的炎癥指標，在白細胞介素(IL)-1、IL-6 和TNF 刺激下，由肝臟中被激活的巨噬細胞合成。Li[3]等人的研究發現在內毒素導致的肺損傷模型中，CRP 發生了明顯的升高。Steven Bozinovsk[4]的研究認為SAA可以作為慢性阻塞性肺部疾病急性發作的標志物。

S100 A8 蛋白是近年來發現的一種低分子量鈣結合蛋白，具有抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡及參與炎癥反應等作用[5]。該蛋白主要由激活的中性粒細胞、單核巨噬細胞釋放，反過來在炎癥反應時通過改變細胞骨架結構，增加白細胞變形的能力，使大量的白細胞通過變形滲透到反應部位或聚集到微血管處，導致炎癥反應的級聯放大進而加重損傷。此外，研究發現 S100A8 蛋白同NFкB 和MAPK 通路也有著密切的關系。Szekanecz[6]等研究發現NFкB 通路抑制劑能夠明顯的抑制S100A8 介導的促炎因子的產生。Endoh[7,8]等研究發現鈣衛蛋白同其受體RAGE 的相互作用可使P38MAPK、ERK 和SAPK/JNK 磷酸化導致激活進而導致炎癥反應。

凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1，簡稱TSP-1)，是一種細胞外糖蛋白，可由多種細胞分泌，如肺泡細胞、巨噬細胞、單核細胞等。TSP-1 與TGF-β 有高度的親和性，能夠有效的促進TGF-β 由潛在形式進入激活狀態，它能夠促進膠原纖維的產生和基質沉淀，調節纖維蛋白溶解酶的產生，具有重要的抗炎癥作用[9]。Sakurai[10]等研究發現阻斷TGF-β 的激活可以有效的減輕機械通氣導致的肺損傷，而TSP-1 為TGF-β 重要的激活因子。

本研究利用iTRAQ 技術構建了肺葉切除術患者單肺通氣前后的差異表達蛋白圖譜，為進一步的了解單肺通氣肺損傷的發病機制，并進行早期的干預和治療提供了重要的理論和實驗依據。但本實驗僅為初步研究，樣本量相對較少，所篩選出的一系列差異蛋白尚需擴大樣本量進一步驗證。