基于一體化微球物鏡的超分辨成像系統*

宋揚 楊西斌 閆冰 王馳 孫建美 熊大曦

1) (上海大學機電工程與自動化學院,上海 200444)

2) (中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所,光與健康研究中心,蘇州 215163)

利用直徑微米量級的透明微球與傳統光學顯微鏡相結合,可以在白光下實現超分辨成像.目前大部分研究是將微球直接播撒到樣品表面,由于微球位置的隨機性和不連續性導致無法實現特定區域的完整成像,極大限制了該技術的使用范圍.使用微探針或微懸臂黏附微球,通過三維位移臺精確控制微球位置,一定程度上解決了上述問題,但是需要對微球位置進行精準操控.本文提出了一種結構穩定、參數可控、簡單易用的基于一體化微球物鏡的超分辨成像系統,對微球與物鏡進行了一體化安裝設計,通過設計側視成像及位置反饋系統實現了對微球、物鏡和樣品三者之間距離的精準控制,結合通用的顯微成像系統,實現了對可控特定區域的超分辨成像.該系統將普通顯微物鏡(40×,NA 0.6)的分辨能力提高了4.78倍,最高可以看到100 nm的樣品特征.該一體化物鏡可以搭配普通光學顯微系統使用,實現超分辨成像,提高了微球超分辨技術的通用性,在亞衍射極限樣品的超分辨成像方面具有廣泛的應用價值.

1 引 言

傳統光學顯微鏡受到衍射極限的限制,最高橫向分辨率約為200 nm,難以觀測亞衍射極限樣品的特征.近年來,多種超分辨熒光顯微成像技術逐步出現,根據不同的成像原理,超分辨顯微成像技術可分為兩大類: 1)利用單分子定位方法突破衍射極限,包括隨機光學重建顯微術(STORM)[1]、光激活定位顯微術(PALM)[2]和fPALM技術[3]等;2)改變光源照明方式,調制點擴散函數(PSF)來實現分辨率的提高,例如受激發射損耗顯微術(STED)[4]、結構光照明顯微術 (SIM)[5]和飽和SIM技術[6]等.然而,上述超分辨熒光技術受限于熒光分子自身特性,無法在白光照明下實現超分辨成像.

Wang等[7?9]提出了微球超分辨成像技術,借助直徑微米級的透明電介質微球,利用微球對入射光的亞波長聚焦特性,傳統光學顯微鏡可以在白光下實現 50 nm 分辨率的成像,如圖1(a)所示,為實現超分辨成像提供了一種全新的方法.2013年,Li等[10]將微球浸沒水中,實現了對75 nm腺病毒的白光成像;Hao 等[11,12]和 Darafsheh 等[13?15]直接將微球半浸沒或全浸沒在酒精或異丙醇等介質中,但是這些方式只能對樣品進行一次性觀察,同時浸沒介質的易揮發性嚴重影響觀察的穩定性;隨后,Darafsheh 等[16,17]改進微球使用方法,利用硅膠將鈦酸鋇微球封裝成硅膠薄膜,但硅膠薄膜與樣品的粘黏作用不可避免會損壞樣品表面.在這些使用方式中,微球相對樣品固定,并隨機分布在被觀測樣品表面,這些使用方式導致了微球位置的隨機性和不連續性,無法實現特定區域的完整成像,而且待測樣品被微球及浸沒介質污染,極大限制了該技術的使用范圍.

近年來,國內外學者為了擴展微球超分辨成像技術的應用范圍,進行了大量改進研究.為了實現對微球位置的控制,2013 年,Krivitsky 等[18]通過氣壓吸附或膠水固化等方式將微球固定在玻璃微管尖端上,實現了對間距73 nm的分割正方形的超分辨結構觀察;文獻[19?21]中,研究者先后使用毛細管微懸臂和AFM微懸臂黏附直徑7.5 μm的微球,實現了對DVD光盤的高分辨結構和刻蝕光柵的超分辨結構的觀察;2016 年,Wang 等[22]借助原有AFM系統,將微球黏附在AFM探針尖端上,利用AFM的等高掃描模式和接觸掃描模式,在短時間內實現大范圍超分辨成像,同時避免了探針對樣品的破壞,如圖1(b) 所示;2018 年,陳濤等[23]將鈦酸鋇玻璃微球黏附在鎢探針上,使用多軸微動平臺對微球進行精確操作實現了130 nm的超分辨成像.這些裝置都可以對特定區域進行超分辨成像,但是微懸臂或者微探針的脆弱性會導致其發生損壞.2017 年,Yan 等[24]通過自制透鏡適配器將傳統的顯微鏡物鏡與微球集成一體,實現了超分辨成像,但是該適配器由3D打印而成,精度不高,微調難度較大,同時無法對成像參數進行評價.2018年,新加坡國立大學Chen等[25]使用適配器將物鏡與微球結合為一體,開發了一款微球納米成像平臺,如圖1(c)所示,該設計可以搭配不同類型的物鏡和不同種類的微球,利用步進電機調節微球與物鏡之間的距離.作者使用浸油物鏡(100×,NA1.4)和直徑20 μm的二氧化硅微球在白光下觀測到了23 nm的納米點對特征.在此基礎上,2020年,Phaos等[26]推出了OptoNano系列微球輔助顯微鏡,如圖1(d)所示,在現有的 OptoNano 200 產品中,將微球與物鏡 (50×,NA 0.55)結合為一體,經分辨率板標定,可以實現137 nm的分辨率.

圖1 (a)直接播撒微球成像示意圖;(b)AFM 探針操控微球成像示意圖;(c)微球通用鏡頭適配器;(d)微球輔助顯微鏡OptoNano 200Fig.1.(a) Schematic of spread the microspheres;(b) Schematic of AFM probes control microspheres;(c) The universal lens adaptor for the microsphere;(d)Microsphere assisted microscopy OptoNano 200.

目前存在的微球使用方式各有優勢,但是還未解決系統的易用性和成像參數的可控性等難題.本文理論分析了微球聚焦光斑直徑對超分辨能力的影響,將微球與現有物鏡整合一體,集成側視成像反饋系統,實現了白光下對亞衍射極限樣品的實時觀測,并對系統的成像參數進行分析.理論和實驗結果表明,該系統可以在空氣中實現超分辨成像,極大提升了物鏡性能,精簡了系統結構,提高了微球的適用性,降低了成像系統成本.

2 理論分析及仿真

微球透鏡的超分辨成像能力被廣泛研究,Wang等[7]認為通過微球聚焦產生的光子納米射流效應使其能夠實現超分辨成像,該射流長度可達幾個甚至十幾個波長,其能量最大處被定義為微球焦點,焦點處的半高寬被稱為聚焦光斑直徑,該直徑可以小于半個波長.文獻表明[27?29],成像分辨率會受微球及周圍介質的光學參數影響,包括微球尺寸、折射率、入射光源、周圍介質的折射率和與襯底相互作用等因素.研究發現,更小尺寸的微球(如 <10 μm)可以獲取更高的成像分辨能力,這是由于微球在接觸樣品成像實驗中,其產生的光子納米射流更接近微球與樣品的交界面,此時近場環境下的倏逝波可以被更有效地捕獲,并通過微球轉換成可以被采集的傳播波.然而,由于小尺寸的微球通常成像視場非常小,工作距離很短(基本接觸條件下成像),所以實用性較低,不利于技術的進一步發展.因此,基于此考慮,可以選用較大的微球.本文采用較大尺寸的微球,在保證分辨率的基礎上,試圖增加其工作距離,從而做到非侵入式成像,更好地適應多樣化的樣品觀測.

綜合以上因素,確定相關系統參數對微球成像能力進行仿真,本文選用聚二甲基硅氧烷(PDMS)(折射率n1=1.4 )作為封裝介質,使用鈦酸鋇(BTG)(Cospheric,直徑D1=100 μm,折射率n2=1.9 )微球進行成像仿真分析,設定仿真光源為波長470 nm 的平面波.在對微球的仿真中,光波穿過半封裝于PDMS的鈦酸鋇微球射入空氣中,由于微米量級的微球對光波的諧振作用,光波的傳輸過程滿足以下方程:

其中E是光矢量,k是波數,μ與ε分別是材料的磁導率和介電常數,ω是光波的角頻率.在該模型中,外邊界均采用散射邊界條件,網格大小小于λ/4 以保證模型求解的精確度.

首先研究半封裝于PDMS中的不同直徑BTG微球形成的光子納米射流(photonic nanojet,PNJ)的狀態.如圖2(a)所示,藍、綠、紅三條曲線分別代表直徑50,75 和100 μm的BTG微球形成的光子納米射流沿Z軸方向的光強變化曲線.由圖可知,隨著微球直徑的增加,光子納米射流PNJ越長,微球焦距越長,且焦點處能量越大.圖2(b)表示三種直徑微球形成的光子納米射流半高寬(FWHM)在工作距離增加時的變化狀態,其中黑色直線表示衍射極限 (l/2=0.235 μm),可以看到,直徑越大的微球可以在越長的工作距離下突破衍射極限,如100 μm微球實現超分辨的工作距離<13 μm,75 μm 微球的工作距離 <10 μm,50 μm微球的工作距離 <7 μm,并且在超出此工作距離后半高寬迅速提升,伴隨著明顯的波動.在三種尺寸微球的仿真結果對比中,直徑100 μm微球在較長工作距離內保持FWHM

同時,對直徑100 μm微球及其周圍的電場強度分布進行仿真,結果如圖2(c)所示,圖中顯示光線經過半封裝微球聚焦后形成光子納米射流,該射流位于微球正下方一定距離的空氣中,且中間位置存在明顯斷層.正好與圖2(a)能量曲線中兩個波峰之間的波谷相對應,兩個波峰的強度分別是入射光的7871倍和7797倍,對應的工作距離分別為14.3 和 21 μm.第一個波峰即為微球的焦點,在焦點范圍內,微球聚焦光斑直徑小于λ/2 時,可以實現超分辨成像.后一個波峰是由半浸沒微球的PDMS對光線的匯聚產生的,由于其聚焦光斑直徑較大,工作距離太長,此時微球已經失去了超分辨能力.在圖2(b)中,聚焦光斑在工作距離 2 μm處的直徑最小,值為 150 nm (l/3.13),同時聚焦光斑直徑隨工作距離的增加而不斷增大,在13 μm處超過λ/2 ,隨后聚焦光斑迅速發散,聚焦效果逐漸消失.總而言之,直徑 100 μm 的半封裝 BTG 微球在小于13 μm的工作距離內具有超分辨能力.

圖2 (a) 直徑 50,75 和 100 μm 的 BTG 微球形成的光子納米射流沿Z軸方向的光強變化曲線;(b)三種直徑微球形成的光子納米射流的半高寬變化狀態;(c)在波長470 nm的光源下,直徑 100 μm微球形成的光子納米射流狀態Fig.2.(a) Intensity curve value in Z-axis direction of the photonic nanojet formed by BTG microspheres with diameters of 50,75 and 100 μm;(b) FWHM of the photonic nanojet formed by BTG microspheres;(c) The photonic nanojet formed by 100 μm microspheres at the wavelength of 470 nm.

3 實驗系統

使用仿真中所用的BTG微球和PDMS半封裝介質來制作一體化微球物鏡并裝載到實驗系統中.

實驗裝置及原理圖如圖3所示,實驗裝置由顯微成像系統和側視成像反饋系統組成.在顯微成像系統中,使用主波長470 nm的LED光源進行照明,照明光路使用孔徑光闌和視場光闌進行斜照調節,以提高微球成像質量,使用 CMOS相機(OPLENIC,ΜSC180,分辨率 4912 × 3684 pixels,像素尺寸 1.25 μm × 1.25 μm)接收顯微圖像信息.側視成像模塊由CMOS相機(Mshot,MS23,分辨率1920 × 1200 pixels,像素尺寸5.86 μm × 5.86 μm)搭配光學變焦鏡頭 (XDS-10 A,光學放大率2.8—18×,工作距離 32 mm)組成,與一體化物鏡和電動位移臺 (Shinopto,Nanomotor SNM01,步長 <30 nm)相結合構成側視成像反饋系統,該系統可以輔助制作一體式微球物鏡,同時在使用時對微球成像參數進行精準調節.與OptoNano 200相比,該裝置所具備的側視成像反饋系統可以在成像過程中實時觀測微球狀態,以實現對微球的精準操控,避免微球或樣品造成損壞.

一體化微球物鏡如圖4(a)所示,該物鏡由普通物鏡 (40×,NA 0.6,WD=4 mm)、旋轉套筒和固定套筒組成,使用硅膠將微球封裝在旋轉套筒的平凸透鏡 (Thorlabs,LA1700,直徑D2=6 mm,焦距f=30 mm,中心厚度 1.8 mm,曲率 0.61)上,套筒之間使用超細牙螺紋(螺距P=0.35 mm)連接以實現軸線方向的精細可調.制作過程如圖4(b)所示,主要包括制作分離的金屬套筒,PDMS的滴加和旋涂 (2000 rpm,1 min,形成 10 μm 厚涂層),微球的黏附和加熱固化 (90 ℃,30 min).其中,需要將物鏡安裝在顯微系統上,使用側視成像反饋系統黏附微球.側視成像反饋系統如圖4(c)所示,微球黏附過程由側視成像系統拍攝,如圖4(d)所示,首先移動微球至物鏡正下方,此時由于LED光源的照射,微球上呈現亮斑.接著平凸透鏡下壓,直至微球被PDMS吸附,吸附完成后將位移臺下移以避免二次接觸已黏附的微球.這樣就可以將微球與物鏡整合一體化,實現特定區域的超分辨成像.

圖3 微球成像系統原理圖及實驗裝置圖Fig.3.Schematic and experimental set-up diagram of microsphere imaging system.

圖4 (a)超分辨微球物鏡實物圖;(b)超分辨微球物鏡的制作過程,主要包括 1) 套筒的制作,2)PDMS 的涂覆,3)微球的黏附,4)一體化物鏡;(c)側視成像反饋系統實物圖;(d)微球的黏附過程,主要包括1)微球的定位,2)透鏡的下壓,3)微球的黏附,4)位移臺的下移Fig.4.(a) Physical image of the super-resolution microsphere objective;(b) Fabrication of the super-resolution microsphere objective lens.It mainly includes 1) sleeves,2) coating of PDMS,3) adhesion of microspheres,4) integrated objective lens;(c) Physical image of side-view imaging and position feedback system;(d) Adhesion of microspheres.It mainly includes 1) positioning of microspheres,2) downward of the lens,3) adhesion of microspheres,4) downward of the displacement table.

圖5 (a)側視成像反饋系統的標定;(b)標定后的側視成像反饋系統可以對微球的工作距離進行實時測量,此時微球工作距離為 12.65 μmFig.5.(a) Calibration of side-view imaging feedback system;(b) An example of microsphere lens working at a distance of 12.65 μm.

圖6 (a)掃描電子顯微鏡 (SEM)觀測到的 CPU 點陣結構;(b)不使用微球時的觀察效果;(c)?(h)使用直徑 100 μm 微球分別在工作距離 2.78,4.63,5.55,7.72,9.57 和 12.65 μm 處觀察到的點陣效果,每組圖的左側為顯微圖像,其中白色圓圈內是視場范圍,直徑(白色線段)處的灰度值變化曲線如右下角所示,右上角是相應的側視圖.它們都可以有效分辨出200 nm的點陣特征;(i)微球放大倍數與工作距離的關系曲線Fig.6.(a) The CPU lattice structure,400 nm blocks and 200 nm intervals,observed by scanning electron microscope (SEM);(b) the observation without microsphere lens;(c)?(h) the lattice observed at the working distance of 2.78,4.63,5.55,7.72,9.57 and 12.65 μm,respectively,with 100 μm diameter microspheres.The left side of each group of images is the microscopic image,in which the field of view is inside the white circle,the gray value change curve at the diameter (the white line) is shown in the lower right corner,and the upper right corner is the corresponding side-view images.All of them can effectively distinguish 200 nm lattice features;(i) the relationship curve between the magnification factor and the working distance of the microsphere.

其中,在黏附和操控微球之前,需要對側視成像反饋系統進行標定,對USAF1951分辨率板進行成像,所采用的相機單像素尺寸為 5.86 μm ×5.86 μm,該系統最高可以分辨的線對為 (group 7,element 6),標定結果如圖5(a)所示,對應到相機靶面上的圖像分辨率約 0.41 μm/pixel.同時,使用側視成像反饋系統對微球的工作距離進行測量,如圖5(b)所示,圖中下部分的微球是由上方的封裝微球通過樣品反射形成的倒影,兩球間距的一半即為工作距離,此時微球的工作距離為 12.65 μm.通過標定,可以利用該側視成像系統對微球與樣品之間的距離進行實時測量,控制微球超分辨系統工作距離,并防止微球碰觸樣品造成的樣品損傷.

4 實驗與結果分析

為了驗證一體化微球物鏡的成像效果,探究微球工作距離對放大倍數和成像對比度的影響,實驗選用CPU芯片上的微小點陣列作為觀測對象.實驗之前需要對CPU芯片進行清洗,放入丙酮中超聲波震蕩3 min,然后使用酒精沖洗,最后在加熱臺上烘干.

實驗結果如圖6所示,圖6(a)為掃描電子顯微鏡(SEM)觀測到的芯片內部的點陣列特征,該點陣列中特征點長寬為 400 nm,間距為 200 nm,圖6(b)是不使用微球,只通過物鏡對芯片進行觀察得到的結果,該圖像無法分辨規則的點陣列結構.圖6(c)—圖6(h)是使用微球在不同的工作距離上觀測到的一系列圖像,在成像過程中,一直用側視成像系統對微球與樣品之間的距離進行監測,從而測量不同工作距離下的系統放大倍數以及視場范圍.如圖6(c)—圖6(h)所示,每幅圖的左側是微球在不同工作距離下的顯微成像圖,右上角是側視成像系統監測到的相應的微球工作距離,顯微成像圖中的白色圓圈內即為成像視場,圓圈直徑(白色直線)處的灰度變化情況如右下角的歸一化灰度值曲線所示,在成像視場內可以清晰觀測到200 nm的芯片特征,視場之外雖然也有被照亮的區域,但是由于微球球差等因素的影響已無法清晰成像.圖6(i)是一體化物鏡放大倍率隨工作距離的變化曲線,放大倍數隨著工作距離的增加而增大.可以發現,工作距離在 2.78—12.65 μm 之間時,通過使用封裝直徑100 μm微球的一體化物鏡,都可以在一定視場范圍內清晰分辨出200 nm的芯片特征,與仿真結果相符.此外,經過實際測量,在工作距 離 2.78,4.63,5.55,7.72,9.57 和 12.65 μm處,通過微球可以分別實現 2.55×,2.79×,3.29×,4.26×,4.46×和 5.12×的 放 大 倍 數 ,視 場 范 圍(FOV)分別可以達到 31.27,34.94,36.21,44.18,61.79 和 67.05 μm2.總之,隨著微球工作距離的增加,系統放大倍數逐漸增大,成像視場不斷增加,但是圖像對比度不斷下降.

為進一步量化該成像系統的超分辨成像能力,選用具有周期性條紋 (周期為 300 nm,由 200 nm的線寬和100 nm的溝槽組成)的藍光光盤作為觀測樣品,觀測之前需要將光盤外層的保護膜去掉,將條紋結構直接暴露在空氣中.

圖7 (a)掃描電子顯微鏡(SEM)觀測到的藍光光盤條紋;(b)不使用微球時的觀察效果;(c)使用微球時的觀察效果.左側為顯微圖像,可以清晰地觀察到藍光光盤條紋,其中白色圓圈內是視場范圍,直徑(白色線段)處的灰度值變化曲線如右下角所示,右上角是相應的側視圖.此時的工作距離約為 3 μm,視場范圍約 8.04 μm2Fig.7.(a) The BD-ROM fringe observed by scanning electron microscope (SEM);(b) the observation without microsphere lens;(c) the observation with microsphere lens.The left side of image is the microscopic image,the BD-ROM fringe can be observed clearly,in which the field of view is inside the white circle,the gray value change curve at the diameter (the white line) is shown in the lower right corner,and the upper right corner is the corresponding side-view images.The working distance is about 3 μm and the field of view is about 8.04 μm2.

觀測結果如圖7所示,圖7(a)是掃描電子顯微鏡(SEM)觀測的藍光光盤條紋圖像.圖7(b)是在該成像系統下,不使用微球對藍光光盤進行觀察的圖像,無法看到光盤上的條紋.圖7(c)是在該成像系統下,使用封裝直徑100 μm微球的一體化物鏡觀測的圖像,左側是顯微成像圖,可以清晰看到規則的藍光條紋,其中白色圓圈內是視場范圍,約8.04 μm2,圓圈外雖然也被照亮,但是條紋特征逐漸消失,直徑(白色線段)處的灰度值變化情況如右下角灰度值歸一化曲線所示,可以明顯分辨出與光盤周期性一致的條紋特征.圖片背景從左上至右下發生灰度值漸變,是由于使用孔徑光闌和視場光闌進行了斜照調節,通過調節可以有效提高圖像對比度.右上角為相應的側視成像圖,此時工作距離約為3 μm.在實驗中,隨著工作距離的不斷增大,圖像對比度不斷降低,超分辨效果逐漸消失.

5 結 論

本文設計了一種基于一體化微球物鏡的超分辨成像系統,將微球與物鏡整合一體,結合側視成像反饋系統對微球物鏡的成像參數進行精準調節,實現了可控區域的超分辨成像.通過理論仿真和實驗驗證,使用波長 470 nm光源進行照明,該系統可以在小于12.65 μm的工作距離范圍內觀測到200 nm 的樣品特征,隨著工作距離減小,放大倍數逐漸降低,圖像對比度增加,系統分辨能力增強,當工作距離小于 3 μm時,該系統可以觀測到100 nm的樣品特征.該設計結構簡單,操作方便,可以搭配傳統的明場顯微鏡使用,極大提高了物鏡成像性能,具有廣泛的使用價值.