委陵菜酸改善前列腺癌的作用及機制研究

黃航 葉雪挺 楊宇 陳偉

前列腺癌是男性泌尿生殖系統中最常見的惡性腫瘤之一。在美國每年約有22萬例新增患者［1］，而我國前列腺癌患者發病率約為60.3/10萬，死亡率高達26.6/10萬［2］，嚴重影響老年男性的生活質量，給社會家庭帶來巨大負擔［3］。通過手術、放療、化療及內分泌干預等方法對前列腺癌患者進行治療，但其療效不佳、周期長、復發率高等特點，嚴重影響患者的治療效果及生命安全。因此，積極探索高效、低毒的抗癌新藥對提高患者生命健康具有重要意義。蛇莓是薔薇科植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）Focke的干燥全草，始載于《別錄》，其味甘、性苦寒，具有清熱解毒、散瘀消腫等功效，近年來其抗腫瘤活性日益獲得關注。本課題擬選用蛇莓中活性代表成分委陵菜酸作為研究對象，分別建立體內、體外實驗模型，對委陵菜酸在前列腺癌治療方面的作用及機制開展深入研究，為前列腺癌患者的治療提供新的有效方法，為傳統中草藥蛇莓的臨床應用補充科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人前列腺癌LNCaP細胞，購自美國模式培養物保存中心（ATCC）。細胞培養在RPMI-1640培養基（含10%胎牛血清），隨后置入含5% CO2的37℃培養箱，每天進行一次換液。

1.2 動物 SPF級雄性BALB/c-nu裸鼠（20.5～21.5g）40只，6周齡，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供［SCXK（京）2018-008］。裸鼠置于層流架中飼養。采用無特定病原體的飼料飼喂，溫度（23±2）℃，濕度45%～65%，維持10h光照、14h黑暗交替。

1.3 實驗試劑及儀器 委陵菜酸（HPLC≥98%，PRF7042741），購自上海將來實業股份有限公司；Gemini胎牛血清，購自美國Gemini公司；RPMI-1640培養基，購自美國Hyclone公司；PSA、PPARβ、Twist1、E-cadherin、N-cadherin、vimentin及β-Tubulin抗體，購自美國Cell Signaling公司；HRP標記抗兔二抗、蛋白抽提試劑盒及ECL發光液，購自江蘇碧云天生物技術公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司產品；電子天平，美國Sartorius公司；細胞超凈工作臺，蘇州尚田生物技術公司；酶標儀，購自美國Biotek公司，Western blot轉膜系統、Gel Doc凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；垂直電泳裝置，美國Bio-Rad公司。

1.4 方法 （1）劃痕實驗：取對數生長期的LNCaP細胞置入6孔板中進行培養，待細胞融合至80%～90%時用200μl移液槍頭在中間劃直線，確保每次劃痕寬度一致。采用無菌PBS液清洗孔內脫落細胞，再加入完全培養基進行培養并加入不同濃度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸進行干預。分別在劃痕0h及24h后置顯微鏡下進行觀測，評估細胞遷移情況，并根據劃痕愈合率對給藥前后細胞遷移能力進行考察。（2）Transwell侵襲實驗：取對數生長期的LNCaP細胞，將其稀釋至5×104濃度后取200μl加入包被有Matrigel的Transwell上室，各組孔內分別滴加不同濃度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸進行干預，同時在下室中加入完全培養基，隨后放置在細胞孵育箱中繼續培養24h。培養結束，用棉簽輕柔擦凈上室面未穿過膜層的LNCaP細胞，并置入甲醛進行固定。20min后常溫晾干，采用結晶紫染色20min，用預冷的PBS進行清洗，并放置顯微鏡下進行觀測。（3）細胞內蛋白收集：取對數生長期的LNCaP細胞加入培養皿中進行培養，待細胞融合至80%～90%時進行清洗、換液，并滴加不同濃度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸進行干預，待培養24h后收集細胞，加入裂解液進行低溫裂解。隨后收集至EP管中，根據12000r/min，4℃的條件離心5min，收集管內上清液，分裝并保存于-80℃。（4）移植瘤模型建立［4］與給藥：收集對數生長期的LNCaP細胞，將其稀釋至2×107個/ml密度的細胞懸液。取健康BALB/c-nu裸鼠，術前12h禁食不禁水，用乙醚進行吸入麻醉，仰臥位固定其頭部與四肢，下腹部消毒。隨后切開皮膚分離腹膜，用無菌棉簽推開膀胱使生殖腺葉狀肉紅色的左右葉前列腺腺體充分暴露。將25μl制備好的LNCaP細胞懸液注射在前列腺腺體的背外側薄膜內。還原各組織器官位置，關閉腹腔、分層縫合皮膚。2周后，取造模裸鼠隨機分為移植瘤組、委陵菜酸低劑量（0.75mg/kg）組、委陵菜酸中劑量（1.50mg/kg）組及委陵菜酸高劑量（3.00mg/kg）組。各組灌胃相應劑量藥物，移植瘤組給予等量生理鹽水，累計給藥4周。實驗結束，處死裸鼠并摘取前列腺腺體，剝離其中瘤組織待濾紙吸干后稱質量（M）。測量瘤體的長（a）、短（b）徑。根據公式計算抑瘤率（%）=（M移植瘤組-M給藥組）/M移植瘤組×100%，瘤體積=（a×b2）/2。隨后將部分前列腺癌組織置入10%甲醛溶液固定。剩余部分組織剪碎，加入裂解液后勻漿。在4℃條件下12000r/min離心30min，取上層液至樣品管中，分裝后放置-80℃下保存。

1.5 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 委陵菜酸對前列腺癌細胞遷移及侵襲能力的作用 劃痕實驗結果顯示：與0μmo/L組比較，不同濃度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸干預處理后，細胞遷移距離明顯縮減（P＜0.05，P＜0.01），其中以20μmo/L及40μmo/L的干預作用最強（P＜0.01）。結果見圖1。Transwell小室法結果表明：與0μmo/L組比較，不同濃度（20、40μmol/L）委陵菜酸干預處理后，細胞侵襲數量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），而10μmol/L組與0μmol/L組之間無明顯差異（P＞0.05）。結果見圖2。

圖1 委陵菜酸對LNCaP細胞遷移的影響

圖2 委陵菜酸對LNCaP細胞侵襲的影響

2.2 委陵菜酸對前列腺癌細胞中信號通路相關蛋白表達的作用 WB檢測細胞蛋白結果顯示：在PPARβ、Twist1、N-cadherin和Vimentin表達方面，與0μmol/L組比較，不同濃度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸可明顯下調其表達水平（均為P＜0.05）；在E-cadherin表達方面，與0μmol/L組比較，不同濃度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸可明顯上調前列腺癌細胞中E-cadherin的表達水平（P＜0.05，P＜0.01），其中以20及40μmol/L委陵菜酸作用能力最強（P＜0.01）；結果見圖3。

圖3 委陵菜酸對LNCaP細胞中相關蛋白表達的影響

2.3 委陵菜酸對前列腺癌裸鼠移植瘤的作用 在前列腺癌細胞裸鼠移植瘤模型中，采用不同濃度（0.75、1.5、3mg/kg）委陵菜酸給藥治療后，各組腫瘤質量及體積均出現了下降趨勢，與0mg/kg組比較差異明顯（P＜0.05，P＜0.01）。結果見圖 4。

圖4 委陵菜酸對裸鼠移植瘤的影響

3 討論

前列腺癌晚期患者通常采用雄激素去勢治療（androgen deprivation treatment，ADT）的治療方式，隨著治療的進行而發展為去勢抵抗性前列腺癌。研究發現，腫瘤轉移是前列腺癌患者死亡的重要原因，局限性前列腺癌患者的5年生存率可達100%，但一旦發生轉移其5年生存率僅為31%［5］。而上皮間充質轉化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）在前列腺癌患者的腫瘤轉移與治療抵抗過程中起到關鍵作用，部分殘留的前列腺癌細胞在經過激素療法后可表現出EMT表型。EMT能促進上皮細胞極性消失、粘附能力降低，繼而轉化成具有移動能力的間質細胞，導致細胞間緊密連接消失、細胞獲得遷移能力與侵襲能力。由此可知，抑制前列腺癌細胞的EMT進程對提高患者的生命具有重要意義。近年來，天然產物在抗腫瘤方面表現出明顯優勢，通常具有療效強、毒副作用弱及不易產生耐藥性等特點，尤其在前列腺癌治療方面表現出獨特潛力。

研究表明，腫瘤細胞處于EMT進程時其上皮細胞表型標志物（E-cadherin）表達受到抑制，而間質細胞表型標志物（N-cadherin、vimentin）表達顯著增加，繼而使細胞間連接丟失、移動能力提升［6］。細胞實驗結果發現，委陵菜酸可有效削弱前列腺癌細胞的遷移及侵襲能力，抑制癌細胞中N-cadherin、vimentin的表達，促進E-cadherin表達。由此提示，委陵菜酸可通過調控EMT進程，從而抑制前列腺癌細胞遷移、侵襲。Twist1是EMT進程中重要的觸發因子，可調控E-cadherin或N-cadherin的表達［7］。Twist1在常見的各類腫瘤發生、發展過程中幾乎均有表達，在腫瘤EMT進程及藥物抗性方面發揮關鍵作用［8］，而最新研究顯示Twist1亦參與了PPARβ的信號傳導［9］。PPARβ屬PPAR核激素受體超家族，體內分布廣泛，通常參與脂類代謝、胚胎移植及腫瘤形成等生理病理過程，同樣在前列腺癌中呈高表達狀態，是抑制前列腺癌細胞的重要靶點。實驗結果發現，委陵菜酸可有效降低癌細胞中PPARβ及Twist1的表達水平，由此表明委陵菜酸對EMT的調控作用是通過介導PPARβ/Twist1信號傳導繼而發揮出來的。最后在人前列腺癌裸鼠移植瘤模型中，作者觀察到委陵菜酸可明顯降低腫瘤的質量與體積，阻斷腫瘤組織的疾病進展，此處研究結果與體外細胞實驗一致。

綜上所述，委陵菜酸可有效抑制PPARβ/Twist1信號通路，從而緩解前列腺癌細胞EMT進程，下調其遷移與侵襲的能力。同時本實驗從體外研究轉向體內研究，充分驗證了委陵菜酸抗前列腺癌的藥理活性及作用機制。因此，通過本研究為前列腺癌的臨床治療提供潛在策略，亦為蛇莓的傳統應用補充了科學數據。