原發(fā)性高血壓相關(guān)的線粒體tRNA突變研究

余雪姣 金菊仙 董全勝 陳秀花

原發(fā)性高血壓（Essential hypertension，EH）是一種原因不明、以動(dòng)脈血壓升高為主要臨床表現(xiàn)的復(fù)雜性疾病，是嚴(yán)重的公共健康問題。高血壓中90%為EH［1］，EH是一種由多因素引發(fā)的復(fù)雜性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明，高血壓是一種多基因、多因素、復(fù)雜異質(zhì)性的疾病，線粒體在調(diào)節(jié)血管的各個(gè)方面起到關(guān)鍵的作用［2-3］。線粒體tRNA基因突變是與疾病相關(guān)的突變熱點(diǎn)區(qū)域，已報(bào)道的與EH相關(guān)的線粒體tRNA突變有tRNAMet/tRNAGlnA4401G［4］、tRNAThr G15927A突變［5］等。為了更好的理解線粒體tRNA突變和EH的相關(guān)性，作者開展了EH患者線粒體tRNA突變篩選，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2017年1月在衢州市人民醫(yī)院心內(nèi)科門診和住院的EH患者共200例，其中男150例，女50例；年齡25～70歲，平均47.5歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：EH的診斷符合《中國(guó)高血壓防治指南2010》推薦的標(biāo)準(zhǔn)［6］。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓、白大衣性高血壓、糖尿病、甲狀腺疾病、嚴(yán)重的肝腎功能損害、嚴(yán)重心律失常、惡性腫瘤、感染等疾病。此外，選取100例年齡和性別相仿的健康體檢人群作為正常對(duì)照，其中男70例，女30例；年齡18～66歲，平均40.5歲。

1.2 基因組DNA提取 抽取受試者及正常對(duì)照個(gè)體外周靜脈血2ml于EDTA-K2中，按照Universal Genomic DNA提取試劑盒（TakaRa 4.0）的使用說明提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 線粒體tRNA基因組全序列分析 本研究以提取的全基因組DNA為模板進(jìn)行線粒體tRNA基因組的擴(kuò)增，所需引物參考前期發(fā)表的文獻(xiàn)［7］。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用BigDye末端循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒在ABI 3700全自動(dòng)DNA測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用DNA Star軟件與修正的人類線粒體DNA劍橋參考序列比對(duì)［8］。同時(shí)，對(duì)100例正常對(duì)照個(gè)體進(jìn)行線粒體tRNA基因組擴(kuò)增、測(cè)序分析，方法同上。

1.4 種系進(jìn)化保守分析 通過Clustal X 軟件將人類線粒體基因的變異位點(diǎn)與16種哺乳類動(dòng)物的線粒體基因相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析，得出保守性指數(shù)（Conservation index，CI），分析這些變異位點(diǎn)在種系發(fā)育過程中所起的作用，其中CI＞75%被認(rèn)為有功能學(xué)意義［9］。

1.5 線粒體tRNA致病性突變?cè)u(píng)估 由于線粒體tRNA的高突變率，有研究表明：大部分tRNA變異位點(diǎn)屬于多態(tài)性［10］，因此鑒定致病性的tRNA突變尤為重要。本研究參考以下標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分致病性tRNA突變：（1）在正常人群中的頻率＜1%；（2）CI＞75%；（3）突變是否影響tRNA結(jié)構(gòu)或者引起功能學(xué)的改變［11］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。組間兩兩比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體tRNA突變分析 利用PCR-Sanger測(cè)序法，對(duì)200例EH患者和100例正常對(duì)照個(gè)體進(jìn)行了線粒體tRNA基因組的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后測(cè)序分析，共鑒定了3個(gè)線粒體tRNA突變可能與EH有關(guān)：線 粒 體tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G，而這些突變位點(diǎn)在正常對(duì)照個(gè)體中均未發(fā)現(xiàn)。共發(fā)現(xiàn)5例患者攜帶線粒體tRNA突變，其中2例EH患者攜帶A4435G突變，突變頻率為1%；2例EH患者攜帶T4363C突變，突變頻率為1%；1例患者攜帶A8343G突變，突變頻率為0.5%。這些突變所對(duì)應(yīng)的線粒體tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

圖1 EH相關(guān)的mt-tRNA突變二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 攜帶線粒體tRNA突變的個(gè)體臨床和遺傳學(xué)分析 5例攜帶tRNA突變的患者中，男2例，女3例，發(fā)病年齡52～60歲。2例攜帶A4435G突變的EH患者中，女2例，無EH的家族史。2例攜帶T4363C突變的EH患者，男1例，女1例，均無EH的家族史。1例攜帶A8343G突變的EH患者為男性，無家族史。經(jīng)t檢驗(yàn)，200例EH患者和100例正常對(duì)照個(gè)體，對(duì)其線粒體tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G突變比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 線粒體tRNA突變致病性評(píng)估 根據(jù)致病性的mt-tRNA突變?cè)u(píng)估方法，作者認(rèn)為：線粒體tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G屬于致病性突變，可能與EH有關(guān)（見表1）。

表1 EH相關(guān)的線粒體tRNA變異位點(diǎn)分析

3 討論

本研究對(duì)EH相關(guān)的線粒體tRNA突變的篩查，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，基因測(cè)序比對(duì)后共發(fā)現(xiàn)3個(gè)可能與EH有關(guān)的突變位點(diǎn)：tRNAMetA4435G、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G。從結(jié)構(gòu)上來看，A4435G突變位于tRNAMet的第37位點(diǎn)，與反密碼子毗鄰，該位點(diǎn)在進(jìn)化上高度保守［12］。與其他位點(diǎn)相比，第37位點(diǎn)更易被修飾，修飾后的該位點(diǎn)在反密碼子識(shí)別的高保真度和維持tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)及生化功能的穩(wěn)定性方面均起重要的作用［13］。前期研究表明：攜帶A4435G突變的個(gè)體線粒體tRNAMet的穩(wěn)定性下降了約40%，由此而造成的線粒體蛋白翻譯水平也下降了約50%，引起ATP合成減少，ROS 水平明顯增高［14］。

T4363C突變位于tRNAGln二級(jí)結(jié)構(gòu)反密碼子環(huán)的38號(hào)位點(diǎn)，線粒體tRNAGln為重鏈編碼tRNA，其在16種靈長(zhǎng)類及鼠、牛和爪蟾等物種中是高度保守的。Wong等［15］在一例發(fā)育遲緩、胃腸反流、視網(wǎng)膜炎發(fā)育不良和感音神經(jīng)性耳聾女性兒童患者中發(fā)現(xiàn)了此突變，并證實(shí)T4363C是一個(gè)同質(zhì)性突變。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中上述致病性突變通過與相對(duì)應(yīng)的32位形成W-C堿基配對(duì)，延長(zhǎng)反密碼子莖縮小反密碼子環(huán)，破壞tRNA合成酶識(shí)別和密碼子的配對(duì)，造成tRNA功能障礙，降低線粒體蛋白合成率引起線粒體功能障礙，引起疾病產(chǎn)生。T4363C突變可能對(duì)反密碼子識(shí)別的高保真性產(chǎn)生影響，從而參與疾病的發(fā)生［16］。

A8343G突變位于tRNALys基因的T環(huán)上，對(duì)tRNALys的穩(wěn)定性起著重要的作用。該突變可能導(dǎo)致tRNA代謝下降，影響tRNA的翻譯進(jìn)而影響蛋白穩(wěn)定合成。此外，A8343G突變可能降低tRNA-氨基酰化與延長(zhǎng)因子Tu（EF-Tu）結(jié)合效率，從而影響tRNA的修飾［17］。此外，A8343G突變還參與了線粒體內(nèi)膜ATP-敏感鉀通道的合成，從而影響其活性及線粒體K+的傳送［18］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)線粒體tRNA突變可能與EH有關(guān)，A4435G、T4363C和A8343G突變會(huì)導(dǎo)致線粒體tRNA代謝障礙，引起蛋白合成受阻，最終造成線粒體功能損傷，進(jìn)而參與了EH的發(fā)生發(fā)展。本研究的缺陷是標(biāo)本量較少，后續(xù)的工作還要擴(kuò)大樣本量。