髓源抑制性細胞在卵巢癌患者外周血中的檢測及臨床意義

武榮榮 薛麗麗 李永祥 過勇杰

卵巢癌是一種發病率較高的女性惡性腫瘤，臨床表現復雜多樣且易反復發作是卵巢癌發病的重要表現之一［1］。近年來研究發現卵巢癌的治療效果不佳可能與腫瘤免疫微環境有關［2］。腫瘤免疫微環境主要由免疫抑制性細胞及相關的細胞因子組成，其與腫瘤細胞相互作用，共同介導了腫瘤的免疫耐受，從而影響了免疫治療的臨床效果［3-4］。其中“髓樣抑制性細胞（又稱髓系衍生抑制性細胞）”（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是近幾年來備受關注的免疫抑制細胞［5］，具有強大的免疫調節作用，目前主要在腫瘤免疫逃逸中報道［6］。本資料主要研究卵巢癌患者外周血中MDSCs與卵巢癌疾病的關系，及其免疫抑制因子ARG1、COX-2以及MDSCs分泌蛋白S100A8和S100A9的表達水平對卵巢癌疾病的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 外周血標本選自2017年6月至2019年6月在本院收治的卵巢癌患者40例，平均年齡（42.00±3.62）歲；正常對照組為健康體檢者共30例，平均年齡（45.75±7.49）歲。其中，卵巢癌組單核細胞絕對數為（0.42±0.068）×109，粒細胞絕對數為（3.91±0.59）×109，淋巴細胞絕對數為（1.80±0.21）×109；正常組單核細胞絕對數為（0.41±0.084）×109，粒細胞絕對數為（4.89±0.83）×109，淋巴細胞絕對數為（1.40±0.21）×109，兩組間比較均無明顯差異（P＞0.05）。卵巢癌患者和健康體檢者均簽署知情同意書。實驗方案經嘉興市婦幼保健院倫理委員會同意。

1.2 方法 （1）流式檢測外周血MDSCs的百分比：流式細胞儀為FACS Canto Ⅱ（美國BD Biosciences公司），檢測方法采用免疫熒光標記技術，抗體包括HLA-DR購自美國Beckman Coulter公司，CD11b和CD33購自美國BD Biosciences公司。標本處理方法：新鮮全血50μl，抗體各10μl，混勻，4℃避光孵育20min；加入溶血素（美國BD Biosciences公司）2ml，室溫避光10min，溶解紅細胞；加緩沖液1ml，250×g離心5min洗滌兩次，棄上清液，上機流式檢測。用Diva軟件分析。（2）RT-PCR檢測外周血單個核細胞中各基因的表達：抽取卵巢癌患者和健康體檢者靜脈血5ml，用ficoll分離液（北京灝洋生物公司）分離外周血單個核細胞，用RNA提取試劑盒（北京康為世紀生物公司）提取細胞總RNA，用NanoDrop測光密度（OD值）和計算RNA的濃度。1μg RNA用于cDNA的逆轉錄，反應試劑為TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT kit，熒光定量PCR反應試劑購自日本TOYOBO公司，PCR引物由上海Invitrogen分公司合成。引物序列如下：β-actin上 游 引 物GTGGCATCCACGAAACTACCTT，下 游 引 物GGACTCGTCATACTCCTGCTTG；ARG1上游引物TCCCTGTATATCTGCCAAGGATATT，下游引 物 TTCCTAGTCTGTCCACTTCAGTCAT；COX-2上游引物TAAGTGCGATTGTACCCGGAC，下游引物 TTTGTAGCCATAGTCAGCATTGT；S100A8上游引物TGTCTCTTGTCAGCTGTCTTTCA，下游引物CCTGTAGACGGCATGGAAAT；S100A9上 游引 物GGAATTCAAAGAGCTGGTGC， 下 游 引 物TCAGCATGATGAACTCCTCG。反應條件參照試劑盒說明書。

1.3 ELISA檢測血清ARG1和S100A9蛋白 ARG1 ELISA試劑盒購于北京四正柏公司，S100A9 ELISA試劑盒購于武漢Cusabio公司。方法：分別設標準品孔、待測樣本孔，每孔分別加標準品（試劑盒內）或待測血清100μl，混勻，37℃避光孵育2h。棄上清液，加生物素標記抗體100μl，孵育1h。棄上清液，洗板3次。加辣根過氧化物酶標記親和素100μl，孵育1h。棄上清液，洗板5次。加底物（TMB Substrate）90μl，避光顯色30min。最后加入終止液，終止反應。在反應終止后5min內用全波長酶標儀在450nm波長依序測量各孔OD值。根據標準品繪制標準曲線，計算各個血清樣本的濃度。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDSCs（CD11b+CD33+HLADRLow/-）在外周血中表達的比例 首先研究MDSCs在卵巢癌患者和體檢者外周血中的表達情況。圖1A流式設門描述：先以HLADRLow/-細胞群為分析對象，在該細胞群中選取CD11b+ CD33+的細胞為觀察對象，分析其在總細胞群中所占百分比（見圖1A）。實驗結果顯示，在正常組和卵巢癌組的外周循環中均能檢測到表型CD11b+CD33+HLADRLow/-的MDSCs細胞群，其百分比是正常體檢組（54.54±2.32）%（n=30），卵巢癌組（69.79±2.38）%（n=40），兩組間差異有統計學意義（P＜0.0001）（見圖 1B）。

2.2 外周血單個核細胞中ARG1、COX-2、S100A8和S100A9的mRNA表達水平 通過提取卵巢癌患者和體檢者外周血單個核細胞的RNA，用RT-PCR的方法檢測ARG1、COX-2、S100A8和S100A9基因的表達情況，用β-actin作對照基因，發現ARG1、COX-2、S100A8和S100A9基因在外周血單個核細胞中均有表達。卵巢癌組外周血單個核細胞中ARG1、COX-2、S100A8和S100A9的mRNA表達量明顯高于對照組（P＜0.05），見圖 2。

圖1 A：卵巢癌組和對照組的流式分析圖；B：對照組和卵巢癌組外周血MDSCs表達比例的對比。★★★★P＜0．0001

圖2 ARG1、COX-2、S100A8和S100A9的mRNA表達量在兩組間的對比。★P＜0．05，★★P＜0．01，★★★P＜0．001

2.3 ARG1和S100A9蛋白在血清中的表達 本實驗采用ELISA方法對卵巢癌患者和體檢者的血清中ARG1和S100A9蛋白進行檢測。結果顯示：正常組ARG1的血清濃度為（6.70±0.89）ng/ml（n=30），卵巢癌組ARG1的血清濃度為（37.46±4.28）ng/ml（n=30），與對照組的差異具有統計學意義（P＜0.0001）；卵巢癌組S100A9蛋白的血清濃度為（44.74±4.46）ng/ml（n=30），正常組S100A9蛋白的血清濃度為（10.13±1.88）ng/ml（n=30），卵巢癌患者血清中的S100A9表達明顯高于正常體檢者，兩者有顯著性差異（P＜0.0001），見圖3。

圖3 A：AGR1在對照組和卵巢癌組中的表達水平。★★★★P＜0．0001；B：S100A9蛋白在對照組和卵巢癌組中的表達水平。★★★★P＜0．0001

3 討論

卵巢癌的發病機制以及疾病發生發展尚不明確，發現時常為晚期，因此治療效果欠佳。有研究認為，卵巢癌患者體內存在腫瘤免疫微環境，通過多種途徑和機制發揮負向調控免疫應答的功能，并分泌相關細胞因子間接抑制機體免疫應答［4］。所以，考慮免疫抑制性細胞可能對卵巢癌疾病的發生發展有重要的促進作用。

MDSCs是一群缺乏淋巴系標志具有多方向分化潛能和免疫抑制功能的異質性細胞，通過多種機制影響髓系細胞增殖、抑制宿主抗腫瘤免疫、誘導免疫耐受以及促進炎癥反應［7］。MDSCs有多種免疫抑制作用，一方面可以直接抑制淋巴細胞（T細胞和NK細胞）的增殖，減少其細胞因子的分泌；另一方面能抑制巨噬細胞的吞噬能力，通過抑制MHCⅡ表達，減少MHCⅡ和抗原復合物結合，降低T細胞的特異性識別作用，從而減少T細胞釋放刺激巨噬細胞吞噬能力的淋巴因子，這也間接抑制了巨噬細胞的功能。本實驗結果證實，卵巢癌患者外周血中MDSCs的表達量明顯高于健康人群，說明MDSCs細胞在卵巢癌患者的發病中確實起到了免疫抑制的作用，而這個具體的作用機制還需進一步的研究發現。

另外MDSCs 中的一些關鍵性調節酶的表達升高也能引起免疫抑制反應，其中常見的有ARG1和COX-2。ARG1的表達越高，L-精氨酸的含量就越低，從而產生大量的過氧化物，導致免疫炎癥反應的發生。而COX-2作為重要的免疫抑制因子，是炎癥反應和免疫反應的重要參與者。本資料中，在卵巢癌患者和健康人群外周血單個核細胞中均檢測到了ARG1和COX-2的mRNA表達，其中卵巢癌患者的表達量明顯高于健康人群，進一步證實了免疫抑制對卵巢癌疾病發生發展具有重要的作用。而S100A9是由MDSCs分泌的主要功能蛋白，其與S100A8蛋白形成復合物可以直接和NADPH氧化酶復合體成分結合，這種結合可以促進MDSCs中NADPH氧化酶的激活從而增強ROS的產生，并引起抑制效應。作者也在卵巢癌患者的外周血單個核細胞以及血清中檢測到S100A8和S100A9的表達明顯高于健康人群。因此，可研究以S100A9為治療靶點，通過降低MDSCs的細胞數以及減少調節性酶ARG1和COX-2的表達，改善卵巢癌疾病的免疫抑制，從而緩解疾病的進展。但是局限于本研究病例數有限，還需要進一步擴大病例來驗證這些因子能否作為治療的靶點。