活性炭微生物限度檢查方法探究

鄒 云,孫 康,陳 芳

（1.宣城市食品藥品檢驗中心，安徽 宣城 242000；2.中國林業科學研究院林產化學工業研究所，江蘇 南京 210042；3.寧國市食品藥品檢驗所，安徽 寧國 242300）

0 引言

活性炭（供注射用）標準收載于《中國藥典》2020年版四部,是2015版時新收載的藥用輔料[1],較之前用于注射劑的木質活性炭標準顯著提高,其中對微生物有明確的限度要求,具體檢驗方法應按藥典要求進行方法適用性試驗,但因活性炭外觀顏色、理化特性比較特殊[2],在全面考慮試驗的同時要強調注意事項,因為關鍵點直接影響方法運行的可行性。

1 材料與試劑

1.1 活性炭（供注射用）樣品

寧國市恒達活性炭有限公司,批號為20201104（記為樣Ⅰ）、批號為20201105（記為樣Ⅱ）、批號為20201104（記為樣Ⅲ）活性炭（供注射用）樣品采用干熱滅菌工藝生產,國內首創,活性炭（供注射用）產品研發項目列入2020年度安徽省重點研究與開發計劃長三角科技創新聯合攻關專項。樣品為黑色粉末,粉碎度61～75 μm（200～240目）占80%以上,依據《〈中國藥典＞2020年版四部》質量標準檢驗[1]。

1.2 培養基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養基、胰酪大豆胨液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、腸道菌增菌液體培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、麥康凱液體培養基、麥康凱瓊脂培養基、RV沙門增菌液體培養基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基、三糖鐵瓊脂培養基（以上培養基生產廠家均為北京三藥科技開發有限公司）、氯化三苯基四氮唑（TTC,紅四氮唑,羅恩試劑）。

1.3 菌種

大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44 102]；乙型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC（B）50 094]；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]；銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10 104]；枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63 501]；黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98 003]；白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98 001],以上菌種均來自北京三藥科技開發有限公司,中國食品藥品檢定研究院監制。

1.4 儀器

恒溫培養箱和Ⅱ級生物安全柜。

2 試驗環境

該方法適用性試驗在環境潔凈度D級背景下的B級單向流空氣區域內進行。試驗全過程嚴格遵守無菌操作,防止再污染。單向流空氣區域、工作臺面及環境已定期按醫藥工藝潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現行國家標準進行潔凈度驗證合格[3-4]。

3 菌液制備

按藥典操作制成不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和白色念珠菌的菌懸液。

4 微生物計數方法適用性試驗

根據供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。取供試品10 g,用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL溶解或稀釋制成1∶10供試液。但因樣品外觀顏色等特殊性,稀釋后的樣品溶液顯墨汁樣深黑色,平皿法培養后進行微生物計數時,不利于需氧菌、霉菌和酵母菌菌落的觀察、識別和計數。先后經多次試驗：（1）1∶10供試液取1 mL每皿試驗時因活性炭顏色太深試驗組無法計數。（2）1∶10供試液取0.5 mL每皿試驗時也因活性炭顏色太深試驗組菌落無法計數。（3）采用薄膜過濾法,因1∶10供試液中活性炭顆粒過大,無法通過濾膜被截留,此方法不可行。（4）采用低速離心（500 r/min,離心5 min）法,雖然將1∶10供試液中的活性炭固體物質分離,但除黑曲霉外的4種菌回收率均達不到,考慮活性炭吸附力較強所致,此法不可行。（5）采用1∶10供試液取0.2 mL每皿試驗,結果各菌回收率達到要求,且便于觀察計數,此具體試驗過程及數據如下。

4.1 供試液的制備

取供試品10 g,加入100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,搖勻,使分散均勻,制成1∶10供試液[5]。

4.2 接種和稀釋

4.2.1 試驗組取上述制備好的1∶10供試液0.2 mL共10份,分別置10個直徑90 mm的無菌平皿中,每皿分別加入上述制備好的不大于100 cfu/mL菌液1 mL,再分別注入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂（含0.001%TTC）或沙氏葡萄糖瓊脂培養基,混勻,凝固,倒置培養。為了保證科學準確,先加的5皿菌落平均值為1份,后加的5皿菌落平均值為平行制備的第2份,每種菌均按上述方法試驗。

4.2.2 供試品對照組取制備好的供試液,以稀釋液代替菌液,同試驗組操作。

4.2.3 菌液對照組取上述制備好的不大于100 cfu/mL菌液1 mL,置直徑90 mm的無菌平皿中,注入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂（含0.001%TTC）或沙氏葡萄糖瓊脂培養基,混勻,凝固,倒置培養。每個菌種平行制備2平皿,按規定條件培養、計數。

4.3 回收率試驗數據與結果

樣Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ的測量數據分別如表1—3所示。

表1 樣Ⅰ測量數據

表2 樣Ⅱ測量數據

表3 樣Ⅲ測量數據

4.4 結果判斷

試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5～2范圍內；從表1,2和3可知,若各試驗菌的回收試驗均符合要求,對照所用的供試液制備方法及計數方法進行該供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數,上述試驗比值均符合要求。

5 控制菌檢查方法適用性試驗

5.1 大腸埃希菌

5.1.1 供試液制備

同上述4.1制備的1∶10供試液。

5.1.2 試驗菌大腸埃希菌[上述制備好的不大于100 cfu/mL菌液]。

5.1.3 操作方法

取胰酪大豆胨液體培養基4份,每份100 mL,第1份加入1∶10供試液10 mL,第2份加入1∶10供試液10 mL及不大于100 cfu的大腸埃希菌液（1 mL）,第3份加入不大于100 cfu的大腸埃希菌液（1 mL）,第4份加入與供試品溶液等量的稀釋劑10 mL。上述4份同置35 ℃培養箱中培養18 h后,各取1 mL,接種至100 mL麥康凱液體培養基中,43 ℃培養24 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上,35 ℃培養18 h,看平板菌落生長情況（見表4）。

表4 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(麥康凱瓊脂培養基)

5.1.4 結果判斷從表4可以看出,加入菌液的供試液均檢出試驗菌,說明供試品對大腸埃希菌無明顯抗菌作用,該控制菌檢驗方法的專屬性好,方法可行。

5.2 沙門菌

5.2.1 試驗菌乙型副傷寒沙門菌[上述制備好的不大于100 cfu/mL菌液]。

5.2.2 操作方法

取胰酪大豆胨液體培養基4份,每份100 mL,第1份加入供試品10 g,第2份加入供試品10 g及不大于100 cfu的乙型副傷寒沙門菌液（1 mL）,第3份加入不大于100 cfu的乙型副傷寒沙門菌液（1 mL）,第4份作為空白對照。將上述4份同置35 ℃培養箱中培養18 h后,各取0.1 mL,分別接種至10 mL RV沙門增菌液體培養基中,35 ℃培養箱培養18 h后,取少量RV沙門增菌液體培養物分別劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上,35 ℃培養18 h,看平板菌體生長情況。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種,培養18 h,查看培養結果（見表5）。

表5 沙門菌檢查方法適用性試驗

5.2.3 結果判斷從表5可以看出,加入菌液的供試液均檢出試驗菌,說明供試品對沙門菌無明顯抗菌作用,該控制菌檢驗方法的專屬性好,方法可行。

6 結語

活性炭（供注射用）微生物限度檢查中：微生物計數法（需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數的檢查）采用培養基稀釋法,即稱取供試品10 g,加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL,混勻,作為1∶10的供試液。取1∶10供試液按0.2毫升每皿進行注皿試驗（5皿合計為1 mL計數）；控制菌檢查用常規法,大腸埃希菌檢查取1∶10供試液10 mL加至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中進行增菌培養后按規定試驗；沙門菌檢查稱取10 g供試品加至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中進行增菌培養后按規定試驗。

因活性炭（供注射用）樣品為黑色,影響菌落觀察計數,使用的胰酪大豆胨瓊脂培養基需加TTC使含0.001%TTC,以便菌落顯色觀察計數；含供試液的平皿注入培養基后要格外注意手動慢搖,使供試液充分分散并與培養基混合均勻。