黑果枸杞離體培養技術研究進展

周玉麗　王寧寧　張雪平

摘 要：黑果枸杞是我國西北地區重要的防沙固土和藥用藤本植物，離體培養技術是其快速繁殖幼苗的一種重要途徑。該文綜述了黑果枸杞離體培養技術的研究進展，并對其在實際生產中存在的問題進行了探討。

關鍵詞：黑果枸杞;離體培養;進展;問題

中圖分類號 S567.9文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）12-0020-03

Abstract： In vitro Culture technology is an important way for rapid propagation of plant seedlings. Lycium ruthenicum is an important medicinal vine plant for sand control in Northwest China. In this paper， the main key technology of in vitro culture of Lycium ruthenicum was summarized， the research status of in vitro culture technology was analyzed， and the in vitro culture technology of Lycium ruthenicum and the problems in its practical production were discussed.

Key words： Lycium ruthenicum; In vitro Culture; Progress; Problems

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為枸杞屬（Lycium）小灌木，在我國主要分布在西北多地及西藏等地[1]。球形漿果、紫黑色，果實味甜多汁，富含蛋白質、微量元素、維生素等[2]，食藥兼用[3]。黑果枸杞提取物具有降血脂[4]、降血糖[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]、抗變異及抗腫瘤[8]等生理作用，具有較高的開發價值和應用前景。黑果枸杞具有抗旱、耐鹽堿、防風、固沙和護水等生態功能[9]。因此，研究黑果枸杞具有較高的經濟和生態價值。

植物離體培養技術能夠為育種、品種保存和大規模種苗生產帶來可觀的經濟效益，具有廣闊的發展空間及潛能[10]，目前，在細胞生物學、遺傳學、培養細胞突變體和人工種子等方面也開始發揮重要作用[11-12]。筆者對黑果枸杞離體培養的外植體選擇及消毒、愈傷組織誘導、分化及不定芽增殖、生根等方面的研究現狀進行了歸納及整理，以期為黑果枸杞的離體培養研究提供參考。

1 黑果枸杞組培快繁培育的研究進展

目前植物器官、組織及原生質體等均能培養再生植株[13]。黑果枸杞的離體快繁或植株再生大多選用4個步驟：（1）愈傷組織的誘導，通常采用葉片或莖段誘導;（2）叢生芽的分化，通過使用不同植物生長調節劑，對愈傷組織進行分化調節，得到較好的叢生芽分化體系;（3）植株的擴繁，通過篩選培養條件，優化出最佳增殖配方;（4）最后再進行生根培養。也有部分利用無菌苗葉片直接誘導再生植株的相關研究[14]。目前能查閱到較早有關黑果枸杞離體培養的文獻是浩仁塔本的研究[15]，他以帶腋芽的嫩莖段作為材料，成功誘導出不定芽并生根移栽成活。

1.1 外植體的選擇及消毒 外植體的選擇在植物離體培養中至關重要。黑果枸杞離體培養的外植體大部分采用種子播種的無菌苗。現有相關文獻資料表明，黑果枸杞離體培養選擇種子[16-21]、帶芽莖段[15，22-24]作為外植體較為常見，但也有以葉片[14，25-26]作初代培養的初始材料。獲得無菌外植體是離體培養成功的前提，不同外植體所需消毒劑和消毒時間均不相同[27]。升汞是一種常用的消毒劑，相關研究表明黑果枸杞枝條一般選用0.1%升汞，對黑果枸杞嫩枝的消毒效果較好[28]，但通常會選取酒精進行滅菌前輔助消毒，滅菌時間長短應根據不同的外植體類型來確定。相關研究表明，升汞消毒時間在2.5～16min[22，28-29]，相差較大的原因可能與取材的季節相關，采樣時間對外植體消毒時間影響極大，為達到理想效果，夏秋消毒時間最長能達到16min[28]，春季相對短一些。種子作為外植體，選用1.5%～8%次氯酸鈉溶液[14，17-18，20-21]處理3～10min即可達到預期效果。

1.2 愈傷組織的誘導 愈傷組織培養是植物離體培養常見的培養形式[30]。培養基的成分是植物組織能夠正常生長的關鍵因素，大多數都選用MS基本培養基[15，17，23]，也有在啟動培養時用1/2MS和B5培養基[31]。植物生長調節物質的濃度和比例對調控培養物的生長和形態影響最大[32]。常用于黑果枸杞愈傷誘導的植物生長調節劑有2，4-D、NAA和6-BA。楊寧等[17]研究其無菌苗葉片誘導愈傷時，未添加任何植物生長調節物質的培養基亦可長出少量愈傷，但出愈率很低。李琳等[18]研究顯示，2，4-D能夠誘導黑果枸杞細胞脫分化，其激素比例為6-BA∶2，4-D=1∶2;曹君邁等[14]研究同樣證實了上述試驗結果，即添加0.4mg/L 2，4-D可以誘導葉片形成較好的愈傷組織;但也有研究顯示以無菌苗葉片為外植體，可通過添加6-BA和2，4-D（激素比例為5∶1）誘導出較好的愈傷組織，但該研究特別強調較高濃度的2，4-D極易引起愈傷褐化現象[17]。愈傷誘導與外植體材料及植物生長調節劑種類和配比等直接相關[33]，衰老的植株脫分化過程極其困難且容易出現褐化現象。因此，在黑果枸杞外植體誘導愈傷時，建議采用幼嫩組織進行誘導。馬彥軍等[31]以嫩莖為材料，發現NAA能夠取代2，4-D誘導黑果枸杞嫩莖脫分化形成愈傷組織，該研究中選用的激素為6-BA和NAA，激素比例為1∶1，出愈率顯著提高，達到85%。裴小鵬等[25]以青海、甘肅、西藏3地的黑果枸杞為材料，在誘導葉片愈傷時添加6-BA（0.5mg/L）及NAA（0.1mg/L），愈傷誘導率均為100%;黑果枸杞根、莖、葉15d即可誘導出愈傷組織且誘導率均高于98%;孫曉紅等[26]用添加6-BA（1.0mg/L）及NAA（0.2mg/L）的MS培養基100%誘導出了葉片愈傷獲得成功;喬永旭等[34]采用相同激素組合對黑果枸杞子葉、下胚軸和胚根等組織進行誘導，且在激素比例達到6-BA∶NAA=2∶1時誘導率可達到100%。由此可知，適合黑果枸杞愈傷誘導的6-BA濃度在0.2～1.0mg/L[18，26，34-35]，隨著NAA濃度的增加，黑果枸杞愈傷組織的生長狀況越佳，但6-BA濃度過高（1.5～2mg/L）會出現玻璃化現象，愈傷組織的生長狀態與植株生長調節劑直接相關。

1.3 愈傷組織的分化及不定芽的增殖 在離體條件下，不同生長調節劑及濃度組合對愈傷組織分化的效果不盡相同[33]。馬彥軍等[31]研究表明6-BA濃度較低的條件下，細胞分化率可達到80%以上，最高可達92%。汪清銳等[19]同樣使用6-BA作為細胞分化激素，40d后可從愈傷組織中獲得不定芽;隨6-BA濃度的上升，不定芽發生率也增加，但6-BA濃度高于一定值時，不定芽會出現玻璃化現象[35]。玻璃化現象的產生與細胞分裂素濃度有很大關系[36]，當培養基中 6-BA濃度較小時（小于0.4mg/L），不定芽生長基本正常。由此可知，低濃度的6-BA有利于黑果枸杞愈傷組織分化出正常的再生植株。李小艷等[29]在討論初代誘導芽分化的影響時，對促進細胞分裂激動素KT的作用進行了討論，結果顯示當以MS為基本培養基時，添加KT和IBA的組合可以使外植體更快啟動，不定芽相較于添加6-BA和IBA激素的組合更為細弱;但是6-BA與IBA組合的條件下，芽生長的啟動緩慢，長勢也較為平緩。因此，可根據不同要求選擇不同激素組合。陳海軍等[20]通過分析發現，過低或過高的激素濃度均會抑制愈傷組織分化，添加6-BA（0.3mg/L）和NAA（0.05mg/L）最適宜分化形成叢生芽，分化率達80%。喬永旭等[34]研究了不同濃度6-BA、NAA對黑果枸杞愈傷組織分化的影響，結果顯示培養35d后芽開始形成，隨著6-BA/NAA比值的降低，叢生芽誘導率出現上升趨勢，當6-BA和NAA濃度均為0.5mg/L時叢生芽發生時間最早，誘導芽的增殖系數最高。也有部分研究顯示不添加任何植物生長調節劑MS培養基繼代增殖黑枸杞效果較好，增殖系數達到8[29]，這與浩仁塔本[15]、李媛媛[28]、楊寧[17]等研究不定芽增殖結果不一致。而孫曉紅等[26]試驗結果表明，添加1.4mg/L的ZT可以誘導葉片愈傷分化，這與以上大多數研究者研究結果均不同。分析其原因，李小艷等[29]認為在田間能通過扦插繁殖的材料，培養時對植物生長調節劑的需求量會較少或基本不需要，但大多數研究均顯示單獨添加6-BA，或6-BA與NAA、IBA組合有利于不定芽增殖。

1.4 生根培養 黑果枸杞組培苗生根常用的生長素為IBA[17，24-25]，但也有少數在生根培養基中混合添加IBA和NAA[19，26]或只添加IAA[37]誘導不定根。楊寧等[17]研究發現較低濃度IBA（0.2mg/L）生根率極高，可達到95%。李媛媛等[28]研究表明，當IBA濃度為0.1～0.2mg/L時，1/2MS相較于MS培養基效果更佳。馬彥軍等[31]將NAA和IBA進行組合得到了黑果枸杞組培苗較好的生根效果，這與汪清銳等[19]研究結果基本一致。裴小鵬等[25]研究表明添加0.2～0.3mg/L的IBA的1/2MS培養基適宜生根。由此可知，多數研究者認為1/2MS培養基添加0.1～0.3mg/L的IBA生根效果較好。

2 問題與展望

近年來黑果枸杞野生資源遭到破壞性采挖[14]，其生存生態環境日趨惡化[[38]，人工栽培黑果枸杞勢在必行。雖然黑果枸杞扦插技術較為成熟[39]，但扦插繁殖周期較長[24]，因此，離體快繁是保護黑果枸杞野生資源的有效途徑之一。當前黑果枸杞離體培養研究中的問題主要有培養繼代周期偏長、研究單一化等，今后可以離體培養為基礎，結合現代植物生物技術，開展黑果枸杞的植物生物技術育種，培育黑果枸杞新品種。

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參考文獻

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1978：10.

[2]楊斌，王向未.黑枸杞及其功能性成分在食品工業中的應用及開發進展[J].輕工科技，2014（10）：22-23.

[3]劉愛紅，陳潔，孫美玲.黑果枸杞的營養保健成分及其開發應用研究進展[J].食品工程，2018（4）：5-10.

[4]林麗，李進，呂海英，等.黑果枸杞花色苷對小鼠動脈粥樣硬化的影響[J].中國中藥雜志，2012，37（10）：1460-1466.

[5]汪建紅，陳曉琴，張蔚佼.黑果枸杞果實多糖降血糖生物功效及其機制研究[J].食品科學，2009，30（5）：244-248.

[6]陳晨，趙曉輝，文懷秀，等.黑果枸杞的抗氧化成分分析及抗氧化能力測定[J].中國醫院藥學雜志，2011，31（15）：1305-1306.

[7]陶大勇，陳佳娟，陳瑛，等.黑果枸杞色素對小鼠抗衰老作用的研究[J].中獸醫醫藥雜志，2008（1）：11-13.

[8]唐傳核，彭志英.天然花色苷類色素的生理功能及應用前景[J].食品添加劑，2000（1）：26-28.

[9]林麗，張裴斯，晉玲，等.黑果枸杞的研究進展[J].中國藥房雜志，2013，24（47）：4493-4497.

[10]張宏平，姬愛國，和林濤.植物組培快繁褐化現象研究進展[J].農業工程，2013（5）：128-132.

[11]郭龍芳，薛福東，郭九峰，等.植物組織培養：最新進展和潛在的應用（英文）[J].AgriculturalScience&Technology，2014，15（12）：2088-2095，2099.

[12]史偉，陳志國.枸杞組織培養的研究進展[J].草業與畜牧，2006（10）：5-8.

[14]曹君邁，馬海軍，譚亞萍.離體黑果枸杞再生途徑的研究[J].干旱地區農業研究，2018，36（5）：54-58.

[15]浩仁塔本，趙穎，郭永盛，等.黑果枸杞的組織培養[J].植物生理學通訊，2005（5）：82.

[16]劉思，安文娟，蔡超，等.三種枸杞組培快繁技術的研究[J].吉林業科技，2010，39（5）：8-11，36.

[17]楊寧，李宜珅，陳霞，等.黑果枸杞的組織培養和快速繁殖[J].西北師范大學學報（自然科學版），2016，52（2）：84-88.

[18]李琳，杜倩，梁素鈺.黑果枸杞無菌苗愈傷組織誘導體系的建立[J].林業科技，2018，43（6）：1-3，64.

[19]汪清銳，呂林芳.黑果枸杞組織培養研究[J].山西林業科技，2019，48（1）：31-33.

[20]陳海軍，劉嘉偉，李佳，等.黑果枸杞（Lyciumruthenicum）組織培養與再生體系的建立[J].內蒙古農業大學學報（自然科學版），2018，39（4）：14-23.

[21]戴逢斌，劉麗萍，李艾佳，等.多基因型黑果枸杞高效快繁體系的建立[J].生物技術通報，2019，35（4）：201-207.

[22]張楠，曹后男，宗成文，等.大果黑果枸杞組培快繁技術體系的研究[J].遼寧林業科技，2016（1）：22-24.

[23]劉中雙.黑枸杞組培育苗技術的研究[J].中國林副特產，2018（3）：31-32.

[24]王聰慧，王鐵軍，高芳，等.黑果枸杞離體快繁技術研究[J].森林工程，2019（2）：32-36.

[25]裴小鵬，金芳，李文娟，等.三種黑果枸杞組織培養技術初探[J].甘肅農業大學學報，2018，53（2）：64-68.

[26]孫曉紅，位書磊，宋強，等.黑果枸杞的葉片分化與快速繁殖[J].植物生理學報，2016，52（5）：653-658.

[27]王蒂.植物組織培養[M].北京：中國農業出版社，2004.

[28]李媛媛，趙紅霞，趙學彩，等.黑果枸杞組培無菌體系獲得及組培快繁技術研究[J].山東林業科技，2017，47（6）：22-25.

[29]李小艷，王梅，段鵬慧，等.黑果枸杞的組織培養快速繁殖技術[J].貴州農業科學，2017，45（6）：12-14.

[30]孫劍川，郭團玉.植物愈傷組織誘導培養試驗的方法改進[J].寧德師范學院學報：自然科學版，2018，30（1）：92-96.

[31]馬彥軍，程艷青，張榮梅.黑果枸杞組織培養快繁技術研究[J].林業科技通訊，2015（6）：26-28.

[32]張琨，周淵，單曉菲，等.黃花菜組織培養研究進展[J].北方園藝，2020（2）：130-137.

[33]周宜君，周生闖，劉玉，等.植物生長調節劑對植物愈傷組織的誘導與分化的影響[J].中央民族大學學報：自然科學版，2007，16（1）：23-28.

[34]喬永旭.黑果枸杞高頻再生體系的建立[J].中藥材，2015，38（10）：2031-2034.

[35]冀菲，唐曉杰，程廣有.黑果枸杞組培繁殖培養基選擇[J].北華大學學報：自然科學版，2016，17（4）：537-539.

[36]李春華，王菊英，王紹林，等.激素對彩色馬蹄蓮玻璃化苗及增殖率的影響研究[J].綠色科技，2013（9）：121-122.

[37]胡相偉，馬彥軍，李毅，等.黑果枸杞組織培養技術[J].甘肅農業科技，2015（5）：73-74.

[38]姬孝忠.黑果枸杞育苗繁殖技術[J].中國野生植物資源，2015，34（2）：75-77.

[39]劉克彪，李愛德，李發明.四種生長調節劑對黑果枸杞嫩枝扦插成苗的影響[J].經濟林研究，2014，32（3）：99-103.

（責編：徐世紅）