不同產(chǎn)地五靈脂質(zhì)量研究

李筱婧，汪 晶，2，江阿古麗·艾山，韋英杰，2，許 歡，黃一平，2，江 安，陳 斌，2

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院·附屬省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028； 2. 江蘇省中醫(yī)藥研究院·國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇 南京 210028； 3. 新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州中醫(yī)醫(yī)院，新疆 伊犁 835000）

五靈脂F(xiàn)aecestrogopterori 為鼯鼠科動物復(fù)齒鼯鼠Trogopterusxanthipes Milne －Edwards 的干燥糞便，又名藥本、寒號蟲糞、靈脂等，主產(chǎn)于河北、山西、陜西、內(nèi)蒙古、吉林、新疆等地。其全年均可采收，除去雜質(zhì)，曬干，味咸、甘，性溫，歸肝經(jīng)，具有活血、化瘀、止痛功效，主治胸脅或脘腹刺痛、痛經(jīng)、經(jīng)閉、產(chǎn)后血瘀疼痛、跌撲腫痛、蛇蟲咬傷[1－8]。其主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜類、苷類、有機酸等[9]，其中最主要的雙黃酮類成分是穗花杉雙黃酮（amentoflavone）。目前，國內(nèi)外對穗花杉雙黃酮的抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗微生物、降血糖、擴張血管等多種藥理作用均有研究[10－13]。由于穗花杉雙黃酮的顯著藥理活性與五靈脂的中醫(yī)臨床功效相符，故國內(nèi)外正開展一系列新藥開發(fā)研究。但1990 年版《中國藥典(一部)》僅收載了五靈脂的性狀、炮制、性味、功能、主治等項目，2015 年版《陜西省藥材標準》中收載了其薄層鑒別法，目前并未制訂五靈脂藥材的含量限度，相關(guān)法定藥材標準仍不完善。本研究中對不同產(chǎn)地五靈脂的水分及浸出物含量、穗花杉雙黃酮進行薄層鑒別和含量測定[14－15]進行了研究，為五靈脂藥材的質(zhì)量控制和進一步開發(fā)利用提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、DAD 檢測器和色譜工作站，美國Agilent 公司）；MT5 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為百萬分之一）；ZF－90D 型暗箱式紫外分析儀（上海廣豪分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

穗花杉雙黃酮對照品（批號為111902 －201603，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、磷酸均為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水；五靈脂樣品經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院黃一平研究員鑒定為鼯鼠科動物復(fù)齒鼯鼠Trogopterusxanthipes Milne －Edwards 的干燥糞便，其他信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

根據(jù)外形不同，五靈脂分為靈脂米和靈脂塊，常用產(chǎn)地中大部分為靈脂米，新疆產(chǎn)五靈脂多為靈脂塊，詳見圖1。靈脂米為長橢圓形顆粒，長0.5 ～1.5 cm，直徑3 ～5 mm，表面顏色為黃棕色至黑棕色不等，表面微粗糙，可見淡黃色的纖維，有的略平滑具光澤；質(zhì)輕，易折斷，斷面黃綠色或棕褐色，纖維性；氣微，詳見樣品1 ～9，11 ～12。靈脂塊為不規(guī)則的塊狀，大小不一，表面黑棕色，凹凸不平，斷面黃棕色或棕褐色，間或有黃棕色樹脂狀物質(zhì)，質(zhì)硬，氣腥臭，詳見樣品10。

表1 不同產(chǎn)地五靈脂藥材水分、浸出物含量測定結(jié)果（± s，%，n ＝3）

表1 不同產(chǎn)地五靈脂藥材水分、浸出物含量測定結(jié)果（± s，%，n ＝3）

編號1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12產(chǎn)地內(nèi)蒙古吉林湖北廣東廣東山西山西陜西陜西新疆河北河北批號190102341 20190313 150524 20190515 20190585 20190313 20190301 1903001 1903021 180501 180508 190301水分6.63 ±0.21 8.55 ±0.16 6.63 ±0.23 6.85 ±0.20 7.26 ±0.09 7.52 ±0.13 5.36 ±0.05 5.99 ±0.03 7.20 ±0.13 10.83 ±0.13 5.11 ±0.17 5.66 ±0.32浸出物9.26 ±0.15 10.01 ±0.11 11.20 ±0.12 9.97 ±0.05 8.94 ±0.09 9.73 ±0.08 9.54 ±0.10 10.23 ±0.22 11.07 ±0.23 8.13 ±0.09 10.61 ±0.18 10.53 ±0.25

圖1 五靈脂藥材樣品性狀

2.2 水分測定

參照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0832 水分測定法中第二法（烘干法）[15]，對12 批樣品進行水分測定。取樣品粉末約2 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，開啟瓶蓋在100 ～105 ℃干燥5 h，蓋好瓶蓋，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定質(zhì)量，100 ～105 ℃干燥1 h，放冷，稱定質(zhì)量，至連續(xù)2 次稱定質(zhì)量的差異不超過5 mg 為止，根據(jù)減失的質(zhì)量，計算藥材中含水量（%）。結(jié)果藥材含水量為5.11 % ～10.83 %，詳見表1。

2.3 浸出物測定

參照2015 年版《中國藥典（四部）》通則2201 浸出物測定法[15]。以20%乙醇為溶劑，對12 批樣品的浸出物含量進行測定。取樣品粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加20%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h，加熱回流1 h，放冷后，再稱定質(zhì)量，用20%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，量取濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，稱定質(zhì)量。結(jié)果醇溶性浸出物含量為8.13 % ～11.20%，詳見表1。

2.4 薄層色譜鑒別

取藥材粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，加50 mL 90%甲醇，加熱回流30 min，放冷，靜置，取上清液濾過，取濾液25 mL，蒸干，加2 mL 甲醇溶解殘渣，作為供試品溶液。另取穗花杉雙黃酮對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.2 mg 穗花杉雙黃酮的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取供試品溶液3 μL，對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以異丙醇－濃氨－水（13 ∶1 ∶1，V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁甲醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖2。

圖2 五靈脂薄層色譜圖

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：X－Bridge C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：甲醇－0.1%磷酸（60∶40，V／ V）；流速：1.0mL／min；柱溫：25 ℃；檢測波長：330 nm；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按穗花杉雙黃酮峰計應(yīng)不低于3 000。

2.5.2 溶液制備

取穗花杉雙黃酮對照品2 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成每1 mL 含穗花杉雙黃酮202.6 μg 的溶液，即得對照品溶液。取五靈脂藥材粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用90%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。

2.5.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖3。在該色譜條件下，該成分達到基線分離，分離度大于1.5，理論板數(shù)大于3 000；供試品溶液色譜峰紫外吸收光譜與對照品溶液完全一致，表明其他成分對測定無干擾。

線性關(guān)系考察：取2.5.2 項下對照品溶液適量，配制成質(zhì)量濃度為2.026，4.052，8.104，10.130，16.208 μg／mL的系列標準溶液。按擬訂色譜條件分別進樣10 μL，以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝40.145X－5.513 3，R ＝0.999 9。結(jié)果表明，穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度在2.026 ～16.208 μg ／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取適量同一對照品溶液，按擬訂色譜條件測定，連續(xù)進樣6 次。結(jié)果穗花杉雙黃酮峰面積的RSD 為0.31%( n ＝6)，表明儀器的精密度良好。

重復(fù)性試驗：取12 號產(chǎn)地為河北的五靈脂藥材粉末6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果穗花杉雙黃酮含量的RSD 為0.65%( n ＝6)，表明方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取適量樣品（批號為190301），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣測定。結(jié)果穗花杉雙黃酮含量的RSD 為0.70%( n ＝6)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的藥材粉末0.5 g，精密稱定，分別加入適量穗花杉雙黃酮對照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.5.4 樣品含量測定

取12 批樣品粉末各1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算含量。結(jié)果見表3。

圖3 高效液相色譜圖及紫外吸收光譜圖

表2 穗花杉雙黃酮加樣回收試驗（n ＝6）

表3 不同產(chǎn)地五靈脂藥材穗花杉雙黃酮含量測定結(jié)果（%）

3 討論

本研究中樣品來自各地方藥店及中藥飲片廠，可較真實全面地反映臨床實際應(yīng)用中五靈脂的質(zhì)量。12 批五靈脂中2 批產(chǎn)自廣東，2 批產(chǎn)自山西，2 批產(chǎn)自陜西，2批產(chǎn)自河北，其余分別產(chǎn)自內(nèi)蒙古、吉林、湖北、新疆，合計8 個產(chǎn)地，包括靈脂米與靈脂塊2 種類別。中藥材中含水量超出一定范圍就會直接影響藥材的質(zhì)量，易出現(xiàn)蟲害、霉變、潮解等變質(zhì)現(xiàn)象；浸出物含量是反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，確保其療效確切、質(zhì)量可靠的重要指標，故本研究中對不同產(chǎn)地五靈脂藥材的水分及浸出物含量進行了測定。

本研究中對五靈脂中穗花杉雙黃酮的薄層色譜鑒別進行了改進，多數(shù)文獻中對五靈脂中穗花杉雙黃酮的薄層鑒別均使用聚酰胺薄膜及二氯甲烷－甲醇展開劑系統(tǒng)，聚酰胺薄膜不易操作，斑點拖尾，展開效果較差，重復(fù)性不好。本研究中考察了硅膠G、硅膠GF、聚酰胺薄膜等，確定了硅膠G 板為首選；考察了二氯甲烷－甲醇、乙醇－水、正丁醇－醋酸－水系統(tǒng)及異丙醇－濃氨－水展開系統(tǒng)，通過比較發(fā)現(xiàn)，異丙醇－濃氨－水展開系統(tǒng)的展開效果較好。該方法操作簡便，斑點清晰，且高效、快速、簡便，較其他方法更合理。

本研究中考察了冷浸、超聲及回流的提取方式，以及不同的提取溶劑（乙醇、甲醇、90% 甲醇和80% 甲醇），不同提取時間及提取次數(shù)，最終確定了90%甲醇加熱回流30 min 為最佳提取方法。分別考察了不同流速（0.8，1.0，1.2 mL ／min）及不同柱溫（20，25，30 ℃），結(jié)果在上述色譜條件下，供試品溶液與對照品溶液相同時間出峰一致，綜合分離度及峰形等因素最終選定流動相為甲醇－0.1% 磷酸（60 ∶40， V／ V），流速為1.0 mL／min，柱溫為25 ℃。此外，在測定穗花杉雙黃酮對照品的紫外吸收光譜圖時發(fā)現(xiàn)，在330 nm 波長處有最大吸收，故以此為檢測波長。

通過對12 批樣品薄層鑒別及含量測定發(fā)現(xiàn)，除產(chǎn)地為新疆的五靈脂塊外，其他批次藥材均含有穗花杉雙黃酮，含量在0.035% ～0.050%。考慮靈脂塊是復(fù)齒鼯鼠糞便與尿液的混合物夾以少量砂石干燥凝結(jié)而成，成分較靈脂米有差異，有待深入研究。市售臨床常用五靈脂飲片均為靈脂米，故穗花杉雙黃酮的測定有利于五靈脂藥材的質(zhì)量控制，可為其進一步開發(fā)利用提供參考。